60Coγ射线引起Wistar大鼠放射性皮肤损伤的实验研究

朱贵花 黄从书 刘桂芳 谢光辉 马增春 杨 凌 高 月

1（江西中医药大学 南昌 330004）

2（广东药科大学 广州 510006）

3（军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所 北京 100850）

4（空军杭州特勤疗养中心 杭州 310002）

放射性皮肤损伤不仅是核爆炸、核事故、核燃料处理中的主要伤情，95%以上的临床放疗患者也会出现放射性皮肤损伤。轻度损伤可自愈，重则剧烈疼痛，继发感染，溃疡，坏死［1］。放射性皮肤损伤具有预后不良、易反复、难以治愈等特点，严重影响涉核人员工作效能和公众健康［2］。因此，对急性放射性皮肤损伤评估体系、发生发展机制及防治药物的研究越来越受到国内外相关学者的关注，其研究的首要目标是建立可评价的动物模型，探索其变化特征，以利于药物开发研究。根据相关文献报道，X射线及60Coγ射线均可用于放射性皮肤损伤模型的建立，两种射线对机体的损伤有其不同的特点和规律。X射线是临床上放化疗时最常用的射线，能量高、剂量分布均匀、对称性好、穿透性强。目前常选用X射线建立该模型并进行相关研究，并取得了较好的效果。而60Coγ射线在放射性皮肤损伤模型的建立及相关报道较少，但临床上有些地区仍然使用60Coγ射线进行放射治疗［3-6］。因此，本研究采用60Coγ射线进行造模，通过观察不同剂量的60Coγ射线引起的放射性皮肤损伤，从而找到建立大鼠放射性皮肤损伤模型的最佳方案，为放射性皮肤损伤的进一步研究奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 材料

清洁级雌性Wistar大鼠，8周龄，体重（200±20）g，购自北京维通利华有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2016-0006，饲养于军事医学研究院辐射医学研究所27号院动物房。实验经军事医学研究院辐射医学研究所动物伦理委员会审核批准，批准编号：IACUC-DWZX-2020-773。

1.2 仪器

60Coγ射线放射源（军事医学研究院辐射医学研究所）；激光多普勒血流仪MOORLDI2-BI（摩尔科学仪器有限公司）；脱水机VIP-6（日本樱花）；包埋机KD-BM及组织摊片机KD-P（科迪仪器设备有限公司）；病理切片机RM2016（科迪仪器设备有限公司）；显微镜Nikon Ci-S及成像系统DS-FI2（日本尼康）。

2 方法

2.1 动物分组

Wistar大鼠随机分为3组：正常对照组（Normal control，NC，n=6）、30 Gy照 射 组（Radiation，30 Gy，n=10）和45 Gy照 射 组（Radiation，45 Gy，n=10）。正常对照组不接受照射，其余各组接受臀背部照射。照射前将所有动物使用电推刀将大鼠臀背部皮肤去毛。

2.2 动物皮肤辐射损伤模型的建立

照射前使用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。除正常组外，所有大鼠俯卧位固定于特制模板上，采用60Coγ射线单次局部辐照大鼠臀背部皮肤，非照射部位用10 cm厚的铅砖屏蔽，源皮距为2 m，照射面积为5 cm×3 cm，吸收剂量率217.34 cGy/min，两组实际辐照时间分别为20.49 min和13.48 min，总剂量分别为45 Gy和30 Gy，建立放射性皮肤损伤模型。

2.3 观察指标

（1）观察照后大鼠一般情况，包括大鼠的饮食摄水及体重变化情况，记录大鼠照射区皮肤变化情况并采用皮肤半定量评分方法［3-4］：1分为正常皮肤；1.5分为轻度红斑、干燥；2分为中度红斑、干燥；2.5分为明显红斑、干燥脱屑；3分为干燥脱屑、轻度干燥结痂；3.5分为干燥脱屑、结痂，表皮少量结痂；4分为斑片状湿润脱屑，中度结痂；4.5分为融合性湿性脱屑，溃疡，大量深的结痂；5分为开放性伤口，全层皮肤脱落。（2）照射区皮肤血流检测：使用激光多普勒血流仪测定照后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、45 d、60 d大鼠臀背部血流变化。（3）皮肤组织病理学观察：各组大鼠于照后60 d，取照射区域皮肤组织，使用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后进行切片，行苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察各组大鼠皮肤组织结构改变。

2.4 统计学分析

使用Graphpad prism 5.0软件进行统计学分析，数据以±s表示，大鼠体重、皮肤评分、血流变化采用多因素方差分析进行组间比较，大鼠表皮、真皮厚度采用单因素方差分析进行组间比较，p＜0.05为差异显著，p＜0.01时差异极显著。

3 结果

3.1 动物一般情况

与NC组相比，30 Gy和45 Gy照射组大鼠在照后2周摄食、饮水均减少，体重下降，45 Gy照射组下降更明显（与NC相比，**p＜0.01，***p＜0.001），活动减弱，后慢慢恢复正常，体质量呈逐渐增加的趋势（图1）。在照后第14天出现皮肤损伤后，30 Gy和45 Gy照射组大鼠性情暴躁，精神亢奋，活动增多。

图1 照后不同时间各组大鼠体重变化Fig.1 Changes of body weight at different time after irradiation of all group rats

3.2 不同剂量60Coγ射线对大鼠皮肤损伤的影响

大鼠经不同剂量的60Coγ射线照射后，均出现不同程度的皮肤损伤（图2）。照后7 d，各组大鼠照射区皮肤均无明显变化；照后14～18 d，30 Gy组大鼠出现轻度脱屑，45 Gy组大鼠脱屑明显，并伴有轻度红斑，伤口均未出现破损；照后21 d，30 Gy组大鼠出现显著性红斑、脱皮，皮肤轻微破损但无渗出液，皮肤损伤评分达最大（图3），45 Gy组大鼠伤口破损、局部脓肿，伴有渗出液；照后28 d，30 Gy组大鼠创面面积稳定，伤口轻度结痂，45 Gy组大鼠创面结痂，伤口范围稳定，皮肤损伤评分达最大值（图3）；照后60 d，30 Gy组大鼠创面有新生上皮长出，与正常皮肤相似，45 Gy组大鼠创面有部分伤口仍未愈合。

图2 照后不同时间各组大鼠皮肤变化Fig.2 Changes of skin at different time after irradiation of all group rats

图3 使用皮肤半定量评分评估各组皮肤损伤程度1.0（无损伤）至5.0（严重损伤）Fig.3 Assessment of skin injury in each group using semiquantitative grading from 1.0(no injury)to 5.0(severe injury)

3.3 照后不同时间各组大鼠皮肤血流变化

照后不同时间各组大鼠皮肤血流变化情况见图4和图5。照后60 d，与NC组相比，各组大鼠血流均出现明显变化（图4）。由图4可知，照后7 d，两组大鼠皮肤血流与正常接近；照后14 d，两组大鼠皮肤血流升高，这时皮肤出现脱屑，血管扩张；照后21～28 d，30 Gy组大鼠血流维持在较高水平，考虑与大鼠创面出现红斑有关；照后35～60 d，30 Gy组大鼠皮肤血流与正常逐渐接近，说明伤口逐渐恢复、开始愈合；照后21 d，45 Gy组大鼠血流减少，考虑与大鼠出现溃疡有关。

图4 照后不同时间各组大鼠皮肤血流变化Fig.4 Changes of the skin blood flow at different time after irradiation of all group rats

图5 照后不同时间点各组大鼠血流值变化情况；***p＜0.001，与正常相比Fig.5 Changes of the skin blood flow values at different time after irradiation of all group rats;***p＜0.001,compared with NC group

照后28 d，45 Gy组大鼠血流增加（***p＜0.001），考虑与大鼠创面愈合过程中肉芽组织大量增生有关。照后35～60 d，45 Gy组大鼠血流与30 Gy组相似（图5）。

3.4 观察各组皮肤组织病理形态学改变

正常的皮肤组织皮肤层结构正常，真皮层含有一定数量的毛囊、皮脂腺、汗腺，形态结构正常，皮下组织血管无充血、淤血及炎性细胞浸润；照后60 d，30 Gy组大鼠局部可见表皮层增厚（p＜0.001），鳞状上皮细胞数量增多（黑色箭头）；真皮层胶原纤维含量丰富、排列规则，可见毛囊、皮脂腺等附属器官，未见明显炎症。45 Gy组大鼠可见表皮明显增厚，鳞状上皮细胞数量增多（黑色箭头），少见鳞状上皮细胞胞质空泡化（黄色箭头）；真皮层可见少量纤维细胞（红色箭头），并伴有淋巴细胞点状浸润（蓝色箭头），未见毛囊、皮脂腺等附属器官（图6）。正常的皮肤组织表皮层较薄，真皮层内可见大量的皮肤附属器如皮脂腺、毛囊、汗腺等，它们的存在对于维持皮肤的正常功能具有重要作用。经照射后，可以发现45 Gy组大鼠表皮层明显增厚（p＜0.001），且皮肤附属器数量减少，使皮肤失去了正常功能（图7）。

图6 照后60 d各组大鼠皮肤组织病理改变；彩色见网络版（HE,200×）Fig.6 Pathological changes of rats skin tissues at 60 d after irradiation of all group rats;color online(HE,200×)

图7 照后60 d各组大鼠表皮厚度；***p＜0.001，与正常相比Fig.7 The average of epidermal thickness at 60 d after irradiation of all group rats;***p＜0.001,compared with NC group

4 讨论

放射性皮肤损伤是放射性损伤中较为常见的一种类型，主要发生于单次大剂量照射或多次小剂量照射的患者及与辐射相关的工作者。当射线作用于皮肤时，会使皮肤血管内皮细胞受到损害，导致毛细血管损伤，血管通透性增加，炎性渗出，微血栓形成及微血管阻塞，进而导致皮肤微循环障碍，加重皮肤损伤。临床表现为红斑、瘙痒、脱屑、溃疡、坏死等［7］症状。病理学变化为表皮增生、纤维化、炎性浸润、皮肤附属结构减少等［8］。因此，为深入探讨放射性皮肤损伤的发生发展机制及治疗方法，需要建立放射性皮肤损伤的动物模型。

对于放射性皮肤损伤动物模型的建立，在动物种类的选择上主要有小鼠、大鼠、新西兰大白兔及小型猪［9-12］。小鼠体积小，不易照到局部皮肤；而新西兰大白兔、小型猪体积大，操作不便。照射部位多选用臀背部或双后肢，该部位重要脏器少，便于观察。因此，本次实验选用雌性Wistar大鼠作为造模动物，臀背部皮肤作为照射区域。

目前，放射性皮肤损伤模型的建立主要集中于X射线的研究。相关学者分别选用单次剂量45 Gy、38 Gy、40 Gy、41.5 Gy成功建立了放射性皮肤损伤模型［13-16］。赖梅生等［17］选用单次吸收剂量38 Gy的X射线，观察荆芥连翘汤预防性内服对大鼠放射性皮炎的防治作用；李洋等［18］选用单次吸收剂量40 Gy的X射线，探讨水凝胶治疗大鼠放射性皮炎愈合过程中创面愈合率及其机制。因不同直线加速器产生的X射线，选用的剂量存在一定的差别，但可以发现不管是造模剂量还是药物观察剂量，选用X射线建立放射性皮肤损伤模型的最佳剂量为40 Gy左右。因60Co源的特殊性，对不同剂量60Coγ射线诱发放射性皮肤损伤的报道较少。部分研究者分别使用单次剂量60 Gy、45 Gy、30 Gy、22 Gy60Coγ射线进行造模［19-22］，可以发现剂量梯度较大。因此，本实验选用60Coγ射线进行造模。结合前期相关剂量摸索的基础上，发现当吸收剂量小于20 Gy时，大鼠的皮肤改变及病理变化极其轻微，不足以反映放射性皮肤损伤的特征。当吸收剂量为30 Gy、45 Gy时，其皮肤变化与病理改变较为明显。因此，本次实验选用30 Gy、45 Gy作为进一步研究的剂量。

辐射会导致皮肤微循环障碍，通过检测照射野大鼠皮肤血流变化，可以得出：与正常组相比，30 Gy组、45 Gy组大鼠照射区皮肤血流在红斑期及愈合期血流增加，30 Gy组在辐射中期维持在较高水平，45 Gy组大鼠照射区皮肤血流在溃疡期降低。因此，我们可以得出照射区皮肤血流在红斑出现时，血流增加；在溃疡出现时，血流降低；创面愈合初期时，血流增加，创面愈合后期时降低。

本研究结果显示，30 Gy组、45 Gy组均能建立放射性皮肤损伤模型，但其损伤程度不同。30 Gy组60Coγ射线照射组大鼠皮肤损伤较轻，真皮层可见毛囊、皮脂腺等附属器官，为轻度炎症病变。45 Gy组照射野皮肤遵循红斑、瘙痒、炎性、溃疡及愈合等规律；镜下可见表皮增厚，局部真皮层可见少量纤维细胞，并伴有淋巴细胞点状浸润，皮肤附属器减少，为中度炎症病变。结合照后大鼠皮肤变化、血流变化和病理变化，可以发现45 Gy组更符合放射性皮肤损伤的发生发展过程。综上所述，采用45 Gy的60Coγ射线可获得较佳的放射性皮肤损伤模型，该模型易于观察，取材方便，皮肤损伤明显，可为放射性皮肤损伤的进一步研究奠定基础。