α7烟碱样乙酰胆碱受体激动剂后处理对高胆固醇血症大鼠在体心肌缺血/再灌注损伤的影响

温 超，薛富善，王玉慧，金锦花

虽然药物溶栓、经皮冠状动脉介入治疗和冠状动脉旁路移植术等是临床治疗包括急性心肌梗死在内的缺血性心脏病的主要手段，但由此所致的心肌缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury, IRI)则是影响患者康复和预后的重要因素[1]。研究证实，在正常动物应用高选择性α7nAChR激动剂PNU282987，可对心肌IRI产生明显的保护作用[2]。众所周知，高胆固醇血症是缺血性心脏病的独立危险因素，能明显影响多种干预措施对心肌IRI的保护作用[3]。高胆固醇血症存在情况下，α7nAChR激动剂后处理是否仍具有心肌保护作用？本实验拟评价α7nAChR激动剂后处理对高胆固醇血症大鼠在体心肌IRI影响，旨在为临床防治及相关药物开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物选择及分组 SPF级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，体质量130～150 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。实验前适应性饲养1周，自由摄取饲料和饮用酸化自来水；饲养室内保持安静，温度23～25 ℃，湿度55%～75%，12 h照明/12 h黑暗。将30只大鼠随机分为高胆固醇血症组和正常对照组，各15只。

1.2 高胆固醇血症大鼠模型的建立 参照文献[4，5]的方法，给大鼠喂养高胆固醇饲料(含2%胆固醇和0.5%胆盐)8周，采用美国贝克曼自动生化仪AU480测量大鼠血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)浓度。正常对照组大鼠给予普通饲料喂养8周。

1.3 心肌IRI模型的建立 参照既往文献[6，7]的方法，建立在体心肌IRI模型。术前大鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，气管切开连接小动物呼吸机(HX-101E，成都泰盟软件有限公司)进行机械通气，潮气量2～3 ml/100 g，通气频率60～80次/min。显露右颈总动脉并置管，连接BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟软件有限公司)持续监测动脉血压。于右前肢、右后肢和左后肢皮下置入电极，监测标准Ⅱ导联心电图。显露右颈内静脉，置管后肝素封管，以备静脉给药。通过第4肋间开胸显露心脏，去除部分心包膜，在左心耳与肺动脉圆锥之间，距离左心耳尖端2 mm处结扎左冠状动脉前降支(left anterior descending artery，LAD)，以结扎线远端心外膜发绀或发白，ECG示ST段抬高为LAD阻断成功，30min后松开结扎线，缺血区心外膜颜色恢复红润，抬高ST段降低幅度大于50%为心肌IRI模型建立成功。

1.4 实验方案 采用随机数字表法，将15只高胆固醇血症大鼠和15只正常大鼠均随机分为3组(每组5只)：高胆固醇血症大鼠对照组(hypercholesterolemic rats in control group, HC)和正常大鼠对照组(normal rats in control group, NC)、高胆固醇血症大鼠缺血/再灌注损伤组(hypercholesterolemic rats in IRI group, HI)和正常大鼠缺血/再灌注损伤组(normal rats in IRI group, NI)、高胆固醇血症大鼠PNU282987后处理组(hypercholesterolemic rats in PNU282987 postconditioning group, HPNU)和正常大鼠PNU282987后处理组(normal rats in PNU282987 postconditioning group, NPNU)。

HC组和NC组，在LAD下方穿线但不结扎，观察30 min时经右颈内静脉注射生理盐水1 ml，继续观察120 min；HI组和NI组， LAD 阻断30 min，再灌注前即刻经右颈内静脉注射生理盐水1ml，再灌注120 min； HPNU组和NPNU组：LAD阻断30 min，再灌注前即刻经右颈内静脉注射PNU282987(2.0 mg/kg，总容量为1 ml)，然后再灌注120 min。

再灌注120 min时，全部动物经右颈总动脉取血3 ml，静置30 min，4 ℃离心，收集上清液，冻存于-80 ℃冰箱中待测。使用美国贝克曼自动生化仪AU480，氧化酶法检测血清TC和TG浓度，直接法检测血清LDL浓度，免疫抑制法检测血清肌酸激酶同工酶MB(Creatine kinase isoenzyme，CK-MB)浓度，速率法检测肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ，cTnⅠ)浓度，ELISA法检测血清肿瘤坏死因子α(Tumour Necrosis Factor alpha，TNF-α)和白细胞介素-6(Interleukin 6，IL-6)浓度。

1.5 心肌梗死面积测定 再灌注120 min时，再次结扎LAD，经右颈内动脉注射2%伊文氏蓝溶液1.5 ml，待大鼠口唇和远端肢体皮肤蓝染后，经右颈内静脉注射10%氯化钾处死大鼠，用4 ℃磷酸盐缓冲液洗去表面和心室内残血，沿冠状沟切除左心房、右心房和右心室。放入-20 ℃冰箱冷冻30 min，于LAD结扎水平向心尖方向垂直于左心室纵轴将左心室均匀切成5片，在切片横截面上被蓝染的区域为非缺血区，未被蓝染的区域为心肌缺血危险区(AAR)。将心脏切片放入2 ml含1%氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride,TTC)溶液中，37 ℃避光水浴震荡5～10 min，再置于4%中性甲醛(4 ℃)溶液中固定过夜，存活心肌呈砖红色，梗死心肌呈灰白色。将每张心脏切片照相，采用Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics, Inc, Rockville，美国)图像处理软件进行分析。将心肌梗死区的百分比数值除以缺血危险区的百分比数值，即为心肌梗死面积(Infarct size，IS%)。

2 结 果

2.1 血脂水平对比 与NC组相比(1.90±0.32，0.32±0.05)，HC组血清TC和LDL水平(3.99±0.47，0.90±0.13)明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 血清心肌酶水平对比 在正常大鼠，与NC组相比，NI组和NPNU组血清CK-MB和cTnI水平明显升高(P<0.05)；与NI组相比，NPNU组血清CK-MB和cTnI水平明显降低(P<0.05)。在高胆固醇血症大鼠，与HC组相比，HI组 和HPNU组血清CK-MB和cTnI水平明显升高(P<0.05)。组间比较，与NI组相比，HI组血清CKMB及cTnI水平明显升高(P<0.05)；与NPNU组相比，HPNU组血清CKMB及cTnI水平明显升高(P<0.05)。见表1。

表1 正常和高胆固醇血症大鼠血清cTnI和CK-MB水平比较

2.3 血清IL-6和TNF-α水平 在正常大鼠，与NC组相比，NI组和NPNU组血清TNF-α和IL-6水平明显升高(P<0.05)；与NI组相比，NPNU组血清IL-6和TNF-α水平明显降低(P<0.05)。在高胆固醇血症大鼠，与HC组相比，HI组和HPNU组血清TNF-α和IL-6水平明显升高(P<0.05)。组间比较，与NI组相比，HI组血清IL-6及TNF-α水平明显升高(P<0.05)；与NPNU组相比，HPNU组血清IL-6及TNF-α水平明显升高(P<0.05，表2)。

表2 正常和高胆固醇血症大鼠血清IL-6和TNF-α水平的比较 (n=5；pg/ml)

2.4 心肌梗死面积 HC组和NC组均未接受心肌IRI干预，未观察到心肌梗死。与NI组(51.74±3.47)相比，NPNU组(39.50±3.00)心肌梗死面积明显缩小(P<0.05)，HI(64.34±3.40)和HPNU组(62.20±4.90)心肌梗死面积明显增加(P<0.05)。与NPNU组相比， HI和HPNU组心肌梗死面积明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

在现有的实验研究[8-11]中，常用兔、鹤鹑、小鼠、大鼠、金黄地鼠等动物建立高胆固醇血症模型。由于大鼠心脏血管解剖和分布与人类极为相似，是研究心肌IRI发生机制及其保护措施较理想的动物模型[12]。在本实验中，将1月龄的SD大鼠采用高胆固醇饲料喂养8周后，血清TC和LDL水平明显升高，表明高胆固醇血症模型建立成功,与文献[13]报道一致。

血清CK-MB和cTnI水平是IRI实验研究中评价心肌损伤的常用生物学指标[14，15]。本研究结果显示，正常和高胆固醇血症大鼠发生心肌IRI后，血清CK-MB和cTnI水平明显升高。而且与正常大鼠相比，高胆固醇血症大鼠心肌IRI后血清CK-MB和cTnI水平升高更为明显(P<0.05)，提示高胆固醇血症可加重心肌IRI。本实验证实在正常大鼠，PNU282987后处理能明显降低血清CK-MB和cTnI浓度，这与既往研究结果一致[16]。但是对于高胆固醇血症大鼠， PNU282987后处理组的血清CK-MB和cTnI水平与HI组相比差异无统计学意义。

心肌梗死面积是评价心肌损伤和干预措施心肌保护作用的金标准，而且伊文氏蓝-TTC双染色测定梗死面积已被广泛用于心肌IRI的实验研究[17]。本实验发现，在正常大鼠， PNU282987后处理使IRI后的心肌梗死面积减少23.7%，提示PNU282987后处理均具有良好的心肌保护作用，这与既往研究结果相一致[16]。但是高胆固醇血症大鼠PNU282987后处理后的心肌梗死面积无明显改变，表明高胆固醇血症时PNU282987后处理的心肌保护作用消失，这也与心肌损伤的生物学参数改变相一致。

现有证据表明，IRI是多种因素相互作用的结果，其中炎性反应是最重要的致病因素之一[18]，而IL-6和TNF-α在心肌IRI的炎性反应中发挥着重要作用，是研究心肌IRI炎性反应时最常选用的两个指标[19]。本研究发现，在正常大鼠，PNU282987后处理均可明显降低血清IL-6和TNF-α水平，提示PNU282987后处理心肌保护作用可能与炎性反应抑制有关。再者，HPNU组血清IL-6及TNF-α水平与HI组相比无统计学差异，说明PNU282987后处理对高胆固醇血症大鼠心肌IRI过程中的炎症反应无抑制作用。综合这些结果提示，高胆固醇血症能明显影响干预措施对心肌IRI过程中炎性反应的抑制作用，尤其是PNU282987后处理。

通常认为，后处理治疗IRI最具临床应用价值，尤其是药物后处理[20]。本研究采用贴合临床实际的高胆固醇血症心肌缺血/再灌注损伤模型作为研究对象，通过评价高胆固醇血症对α7nAChR激动剂后处理心肌保护作用的影响，为获得临床可行的心肌保护策略提供了思路和参考。

综上所述，高胆固醇血症可加重心肌IRI并完全消除α7nAChR激动剂后处理的心肌保护作用。炎性反应增强参与了高胆固醇血症影响α7nAChR激动剂后处理心肌保护作用的过程，可能是改善高胆固醇血症时心肌保护干预措施效应的靶点。