近红外光谱法快速测定养生酒的酒精度方法研究
2021-08-30曹晓念刘小刚
袁 强，吉 喆，王 丹，马 康，张 琴，兰 余，曹晓念，杨 洁，刘小刚
（泸州老窖养生酒业有限责任公司，四川泸州 646000）
近红外谱区指波长介于可见区与中红外区之间的电磁波，其光谱波长介于780～2526 nm，可以获得含氢基团的合频及倍频振动吸收，主要包括C-H、N-H、O-H、S-H 等含氧基团的倍频与合频吸收带[1]。近红外光谱吸收峰位置及强度随组分变化而变化，故可以对含氢有机物实现定性及定量分析。近红外是近几十年来发展最快的光谱技术，具有检测速度快、操作简单、稳定性好、样品用量少及适合在线检测等特点，在窖泥[2]、酒醅[3]、白酒基酒[4]、黄酒[5]等酒相关行业内已经广泛应用。
养生酒是以传统白酒为基础，经过科学合理的医药学理论论证，将食药材中的风味、活性等成分有机地融入传统白酒中，满足消费者对更高生活品质追求的需求和对饮酒更愉悦舒适体验的需求[6]。养生酒产品的酒精度是一个要求连续监测的指标，也是影响产品质量的一个重要理化指标，如何对其进行快速、准确的测定，对降低成本、提高产能及产品质量都具有重要的意义，且酒精度检测不同于传统白酒，在国家标准GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》中的方法有密度瓶法、酒精计法，这两种方法都存在受温度波动及酒内溶解的其他醇类物质影响、方法步骤比较繁琐、费时、费力等不足，而且不适合生产过程中在线快速检测。鉴于此，本研究解析了养生酒样品的近红外光谱图，采用偏最小二乘法作为建立数学模型的化学计量学方法，并使用内部交叉验证法对养生酒酒精度含量模型进行优化和验证，结果重复性、稳定性均较好，为养生酒的酒源生产、调配，即时快速分析提供了一种高效、准确、快速的新方法[7]。
1 材料与方法
1.1 材料、仪器
样品：泸州老窖养生酒公司绿豆大曲、茗酿、滋补大曲、天之圣液等共计200 个样品，其样品的酒精含量范围为：38%vol～52%vol。
仪器设备：AntarisII傅立叶变换NIR光谱仪，美国Thermo Fisher 公司，配有透射采样系统、Result操作软件、TQ Analyst 光谱分析软件；DMA5000 密度仪，奥地利安东帕Anton Paar 公司；STAW100 智能酒精度检测仪，济南盛泰电子科技有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 酒精度含量的化学值测定
参照国家标准GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》的检测方法[8]，过程使用STAW100 智能酒精度检测仪进行蒸馏，收集液进DMA5000 密度仪进行酒精度测量，单位为%vol。
1.2.2 近红外光谱的采集与分析
1.2.2.1 数据测量参数
调用RESULTTM集成软件编写采集流程，再设置仪器工作参数。本试验的仪器工作参数为：光谱扫描范围（data range）：12 000～4 000 cm-1；样本和背景的光谱扫描次数（number of scan）：32次（所需时间约30 s）；光谱扫描的分辨率（resolution）：8 cm-1；以空气作为扫描背景，每次测量前均进行背景扫描。每个样品重复扫描3次，开机预热光谱仪2 h。
1.2.2.2 光谱采集
采用l mL 的移液枪吸取酒样，将酒液样品注入1 mm 比色皿中，每次测样前用试纸将比色皿外壁擦干净，放入液体透射腔中进行扫描。
1.2.2.3 数据处理方法
将全部酒样按酒精度从低到高排序后随机选取30 个酒样作为验证集，另随机选出10 个酒样用于检验模型重现性和稳定性，其余的160 个样品用于建立定标模型。
在建模过程中光谱数据经标准归一化(Standard Nomral Variate，SNV)处理和Norris导数平滑滤波后采用偏最小二乘回归法（Partial least square，PLS）建立定量校正模型，以校正集样品的交叉验证均方差(RMSECV)及其相关系数(R)为指标来优化模型，以对验证集样品的预测均方差(RMSEP)来考察模型的预测准确度。
RMSECV 值小，表明定量模型具有良好的预测精度和稳定性；RMSEP 值小表明定量分析模型较好，其值和RMSEC的差值较小，表明该模型具有更好的稳定性[3]。
RMSECV、R、RMSEP 的计算法如下[9]。所有数据处理均在仪器自带的TQ Analyst 软件中进行。
式中：Ci是标准化学测量值，是NIR 预测值，是化学平均值，n 是校正集样品数，m是验证集样品数。
2 结果与讨论
2.1 养生酒的近红外透射光谱图
养生酒中含有的主要组分为水和乙醇，因此水的吸收峰特别强。由近红外吸收光谱图（图1）可以看出，所有样品的谱图极为相似，图示中A、B 表示水分子的特性吸收区域，分别在6900 cm-1与5200 cm-1附近；乙醇分子在近红外光谱区也有明显的特征吸收，主要表现为氢与基团（如OH，CH，CH2和CH3）伸缩振动能级跃迁所引起的倍频和合频，在近红外光谱区内这些含氢基团的吸收频率特别强，同时又比较稳定。如图1 中II 和III，在5917～5617 cm-1是C-H 一级倍频的伸缩振动以及O-H 弯曲振动，4405～4225 cm-1是C-H 和O-H 的弯曲和伸缩振动，8800～7800 cm-1即图1 中I 是C-H 的第二倍频[10]。
图1 养生酒样品的近红外光谱图
2.2 定量分析模型的建立
2.2.1 光谱预处理方法的选择
光谱的标准归一化法（SNV)是用于消除光程变化或样品稀释等变化对光谱产生的影响，同时，对光谱进行求导和平滑来消除光谱基线产生的偏移或漂移，提高光谱的信噪比，从而得到样品更为明显的特征光谱[1]，如图2。表1为分别采用原始光谱、一阶导数光谱和二阶导数光谱进行建模时的RMSECV 和R 值。从表1 可知，采用二阶导数和Norris 导数平滑对光谱预处理时RMSECV 值最小，R值最大，因此效果最好。
图2 二阶导数近红外光谱图
表1 光谱预处理方法对分析模型的影响
2.2.2 光谱范围的选择
表2为使用不同谱区的光谱：全谱带3999.64～10001.03 cm-1、软件推荐光谱带8519.97～8361.83 cm-1、6429.51～6178.81 cm-1、4890.59～4813.45 cm-1与自选光谱带6058.26～5523.13 cm-1、4697.74～4601.32 cm-1的信息建立模型时的RMSECV值，其结果表明，在8519.97～8361.83 cm-1、6429.51～6178.81 cm-1、4890.59～4813.45 cm-1范围内RMSECV 值最小，R 值最大。因此，其最佳谱区为6429.51～6178.81 cm-1、8519.97～8361.83 cm-1、4890.59～4813.45 cm-1。
表2 不同光谱范围的选择对参数的影响
2.2.3 PLS主因子数的选择
采用PLS 法建立定量校正模型时，为充分利用光谱信号的有效信息，同时避免过度拟合现象，需对主因子的阶数进行合理选择[11]。试验表明，随着因子数增加，RMSECV 下降至最低点后略有上升（如表3），因此选用主因子阶数为7。
表3 交互验证均方差随主因子的变化表
2.3 数学模型的可靠性评价
利用建立的定标模型，预测验证集的30 个样品，由表4和图3可以看出，近红外光谱预测值与实测值之间存在高度相关性，30个样品近红外光谱预测值与实测值的R 为0.9986，预测标准偏差(RMSEP)为0.175，说明由此建立的模型预测效果很好，能满足生产中养生酒酒精度的检测精度要求。并用成对t 检验判断两种方法是否存在显著差异，结果显示在0.05 显著性水平下，两种测定方法不存在显著性差异，表明两种方法不存在系统误差。进一步说明，所建的校正模型具有良好的预测能力，可以达到常规分析方法的精度要求。
图3 验证集样品酒精度预测值与实测值相关图
表4 验证集预测值与真实值的比较
2.4 稳定性试验
随机选取10 个样品，采用近红外光谱法分别对其进行10 次重复光谱测定，统计结果见表5。由表5 可知，各样品的标准差（STDEV）都较小。因此，该方法具有良好的稳定性。
表5 稳定性试验
3 结论
本研究利用近红外建立养生酒酒精度的定量分析模型，相关系数R为0.9994，RMSECV 为0.163，主因子数为7，说明模型建立的方法较好；进一步对模型进行验证和评价，验证集的30 个样品近红外光谱预测值与实测值的R 为0.9986，RMSEP为0.175，说明模型的预测效果很好，能满足生产中养生酒酒精度的检测精度要求。通过稳定性试验得到STDEV 为0.040～0.076。因此，傅立叶变换近红外光谱利用标准归一化法（SNV）预处理后，通过偏最小二乘法（PLS）构建养生酒酒精度预测模型在应用上是可行可靠的，并具有良好的稳定性。
