外周血或骨髓肿瘤性NK细胞形态特征观察及其与反应性淋巴细胞的鉴别

王红梅，张慧慧，李兴武（郑州大学第一附属医院检验科，河南省检验医学重点实验室，郑州 450052）

自然杀伤细胞（natural killer cell，NK 细胞）白血病／淋巴瘤在2016版WHO淋巴瘤分类里属于成熟NK／T淋巴瘤，其诊断整合了MICM——组织细胞形态学（morphology）、免疫学（immunity）、细胞遗传学（cytogenetics）以及分子生物学（molecular Biology）的多种辅助检测技术。检验工作者对外周血或骨髓中发现肿瘤性NK细胞普遍缺乏经验，相关专业书籍里也少有描述。笔者将近期工作中发现的6 例确诊NK 细胞白血病／淋巴瘤的肿瘤性NK细胞形态特征进行整理分析，并与骨髓或外周血涂片中反应性淋巴细胞进行比对分析，试图从细胞形态学角度发现一些规律性的线索，以期为NK 细胞白血病／淋巴瘤的诊断治疗提供有价值的证据。

1 材料和方法

1.1 病例来源 6例外周血或骨髓检出肿瘤性NK细胞的患者以及3例反应性淋巴细胞增多的患者，前者分别来自本院血液科、肿瘤科、耳鼻喉科等，后者分别来自本院呼吸内科和急诊内科。9 例患者年龄为18～60岁，男6 例，女3 例。本项目已通过本院科研和临床试验伦理委员会伦理审查（文号：2019-KY-201）。

1.2 仪器与试剂 FACSCanto Ⅱ流式细胞分析仪及其配套试剂、质控品（BD 公司）；Olympus CX-41显微镜；瑞氏－吉姆萨染料购于郑州派尼化学试剂厂；甲醇购于北京化工厂，二者按1 g／500 mL 研磨溶解；磷酸氢二钠和磷酸二氢钾购于天津市科密欧化学试剂公司，按《全国临床检验操作规程》配制pH 6.8缓冲液。

1.3 方法 采集患者外周血或骨髓2 mL，按照实验室SOP 文件进行流式分析；将外周血或骨髓涂片自然晾干后用瑞吉氏染液常规染色，形态学观察成员均为经过培训的技师；将检测到的肿瘤性NK 淋巴细胞的异常表型和细胞形态列表进行分析总结，且与反应性淋巴细胞进行比较。

2 结果

6 个病例的临床特征及FCM 免疫学表型特征总结见表1，其肿瘤性NK细胞的形态分别见图1～6。其异常NK 细胞特征相似，相对一致：胞体较大，且大小不一，形态不规则，有向两端拉长趋势。细胞核形态多样，大部分不规则，随胞体拉长或不规则，染色质聚集呈块状、条索状，核仁不见或模糊不清。胞浆量较丰富，呈灰蓝色（嗜碱性），周围可见多个伪足样突起，向一端或两端延申拖尾，有些细胞靠近核处可见灰白色淡染区，浆内可见多少不等的粗大或细小紫红色颗粒。

图1 病例1侵袭性NK细胞白血病细胞形态（×1 000）

图2 病例2结外NK／T 细胞淋巴瘤鼻型淋巴瘤细胞形态（×1 000）

图3 病例3侵袭性NK细胞白血病细胞形态（×1 000）

图4 病例4结外NK／T 淋巴瘤鼻型淋巴瘤细胞形态（×1 000）

图5 病例5侵袭性NK细胞白血病细胞形态（×1 000）

图6 病例6侵袭性NK细胞白血病细胞形态（×1 000）

3例反应性淋巴细胞增多患者临床诊断分别为肾癌术后感染、感染性发热、EBV感染，其异型淋巴细胞形态归类整理见图7～9，大致分为Ⅰ型，泡沫型或浆细胞型；Ⅱ型，不规则型或单核细胞样型；Ⅲ型，幼稚型或幼淋巴细胞样型。

图7 Ⅰ型即泡沫型或浆细胞型反应性淋巴细胞形态（×1 000）

图8 Ⅱ型即不规则型或单核细胞样型反应性淋巴细胞形态（×1 000）

图9 Ⅲ型即幼稚型或幼淋巴细胞样型反应性淋巴细胞形态（×1 000）

6个病例肿瘤性NK细胞形态特征其与反应性淋巴细胞的鉴别点见表2。

表2 6个病例肿瘤性NK细胞的形态特征及其与反应性淋巴细胞的鉴别

3 讨论

NK细胞是机体重要的固有免疫细胞，来源于骨髓，是除T 细胞、B 细胞之外的第三大类淋巴细胞，其形态上属于大颗粒淋巴细胞，约占外周血中所有淋巴细胞的15%［1］。FCM 分析NK 细胞主要的免疫表型特征为CD3－CD56＋，根据细胞表面CD56 分子表达强度的差异，将NK 细胞分为CD56dim和CD56str亚群。其中外周循环血中90%以上为CD56dim亚群，主要发挥细胞毒作用［1-3］。

病理情况下，NK 细胞恶性增殖导致发生NK细胞相关肿瘤，根据病程不同分为慢性和侵袭性，包括2016版WHO 分类中的慢性NK 细胞增殖性疾病（CLPD-NK）、侵袭性NK细胞白血病（ANKL）、结外NK／T细胞淋巴瘤鼻型（ENKTCL）。

CLPD-NK较罕见，临床进展缓慢［4］，由于病例数量有限，本研究中没有纳入该病相关的骨髓或外周血细胞形态特征分析。

ANKL是系统性的肿瘤性NK 细胞增殖，伴或不伴噬血细胞。具有侵袭性暴发性的临床病程，常与EBV感染高度相关，极少数可能与蚊虫叮咬引起的超敏反应有关。最常见累及的部位依次为骨髓、外周血、脾及淋巴结等，可合并凝血功能障碍、噬血细胞综合症或多器官功能衰竭。肿瘤性NK细胞典型的FCM 免疫表型为：cCD3＋／sCD3－／CD2＋／CD5－／CD56 ＋／CD57－／细胞毒分子（TIA1、颗粒酶、穿孔素）阳性［5-6］。本研究纳入4 例NK 细胞白血病患者的异常NK细胞均经FCM证实，表型符合ANKL白血病细胞的表型，且均伴发噬血细胞综合征。骨髓或外周血中肿瘤性NK 细胞弥散或局灶性分布，胞体及胞核不规则，着色较深，核仁清楚或不见，胞浆丰富，嗜碱性，内含细小或粗大的紫红色颗粒，有多个伪足伸出，呈手镜形或不规则拖尾形。伪足的伸出可能和细胞的侵袭性有关，胞浆中的颗粒可能与细胞毒性物质如颗粒酶穿孔素等有关，辅助肿瘤性细胞的迁移以及杀伤作用，引起细胞因子风暴从而使患者易伴发噬血细胞综合症［7］。

ENKTCL是非霍奇金淋巴瘤中一种少见类型，主要特征是血管破坏和组织坏死明显，肿瘤性NK细胞FCM免疫表型与ANKL 相似，也与EBV 感染高度相关。临床病程呈高度侵袭性，绝大多数患者淋巴结外发病，最常累及上呼吸消化道，鼻腔是典型的累及部位，骨髓累及不常见。但当累及骨髓和外周血时，表现可与ANKL相似。部分患者可合并噬血细胞综合征［8-9］。本研究中纳入2 例ENKTCL患者，肿瘤性NK细胞累及骨髓，细胞胞体均较大，形态不规则，多有不规则伪足伸出，使细胞拉长或拖尾，胞浆内可见多少不等的粗大紫红色颗粒，与4例ANKL患者的肿瘤性NK细胞形态相似。

外周血或骨髓涂片中的淋巴细胞形态多样，ELN形态学工作组将不典型淋巴细胞分为三类描述：（1）不典型淋巴细胞，疑为反应性；（2）不典型淋巴细胞，疑为肿瘤性；（3）不典型淋巴细胞，性质不确定［10］。反应性不典型淋巴细胞英文是atypical lymphocyte，目前更趋向reactive lymphocyte，即反应性淋巴细胞，常以CD3＋CD8＋T细胞为主，也可为B细胞，外周血反应性淋巴细胞83%～97%为T 细胞，4%～17%为B 细胞。反应性淋巴细胞是在病毒、细菌、生物、化学等其他因素作用下被激活成为活化状态时的形态学改变，其本质并没有改变。传统形态学上根据其形态特征分为三型：Ⅰ型，泡沫型或浆细胞型；Ⅱ型，不规则型或单核细胞样型；Ⅲ型，幼稚型或幼淋巴细胞样型（如图7～9）。本研究收集的6例肿瘤性NK细胞形态特征与反应性淋巴有明显的区别，主要表现在：（1）前者胞体及胞核呈高度不规则的长条状或椭圆状，后者为圆形或近似圆形；（2）前者深染的胞浆内含有数量不等的粗大或细小紫红色颗粒，后者很少含颗粒；（3）前者胞浆呈不规则伪足样突起或拖尾，而后者中浆细胞型和幼稚型很少有此现象，单核细胞型虽然可有胞浆凸起，但其伪足常深入红细胞间隙；（4）前者往往单一或均一出现，而后者可几种形态同时出现。

对临床医生而言，快速区分反应性淋巴细胞与肿瘤性淋巴细胞对疾病的诊断与治疗决策相当重要，首选检查是外周血涂片的显微镜形态学检查，但问题是形态学上界定反应性与肿瘤性淋巴细胞有一定的难度。有时淋巴细胞呈现反应性的特点，有时兼有炎症、反应性或肿瘤的特点［11］。NK 细胞肿瘤变时其分子表型发生改变，形态也发生异常，本文只是总结了有限的几例典型的肿瘤性NK 细胞的形态特征，有时不易与肿瘤性T细胞或其他肿瘤性淋巴细胞区别，还需要结合流式细胞术进行分析，但毫无疑问，正确识别外周血或骨髓里肿瘤性NK细胞，不论是在流式细胞术检测之前选择抗体还是对临床疾病的诊断和治疗，都具有重要意义。