电针干预对透镜诱导型近视豚鼠睫状肌中MMP-3、TIMP-3及Col3α1表达的影响△

郝一宪 李土玲 魏慧霞 刘金鹏 郭大东 毕宏生

流行病学调查研究显示，近视在东亚和东南亚地区人群中普遍高发，其中青少年近视患病率为80%～90%，且高度近视患病率较高，为10%～20%，预计到2050年，全球近视人口将增加至50亿[1-2]。近年来，调节在近视发病机制中的作用越来越受到人们的重视。有研究表明，持续近距离工作对睫状肌造成的长期压力可能会引起儿童近视眼的发生[3]。还有研究指出，由于异常自主神经输入导致异常的调节反应，睫状肌可能参与了近视的发生、发展[4]。因此，作为调节反应的关键组织之一，睫状肌在近视的发展中发挥了重要作用，但具体机制尚未完全清楚。作为一种平滑肌，睫状肌由肌纤维束组成，肌束间结缔组织中可见Ⅲ型胶原[5]，而且，基质金属蛋白酶(MMP)以及金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)在睫状肌组织中均有表达。上述蛋白成分的变化不仅影响细胞外基质(ECM)的更新和重塑，而且影响睫状肌的形态和功能变化。因此，睫状肌中上述蛋白成分的异常表达可能与近视的发生、发展有关。本研究旨在探讨MMP-3、TIMP-3和III型胶原α1(Col3α1)在透镜诱导型近视豚鼠睫状肌中的表达变化，同时观察电针干预对其表达的影响，初步揭示睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的表达变化在近视发展过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器与试剂YZ24带状光检影镜(苏州六六视觉科技股份有限公司)；眼科A型超声仪(法国 Quantel Medical 公司)；针灸针(苏州医疗用品厂有限公司，华佗牌)；电子诊疗仪(苏州医疗用品厂有限公司，华佗牌SDZ-Ⅴ型)；荧光显微镜(日本尼康)；Light Cycler®480Ⅱ实时荧光定量PCR仪 (Roche公司)；Elx800 酶标仪(美国 BioTek)；10 g·L-1盐酸环喷托酯滴眼液(赛飞杰，美国艾尔康公司)；4 g·L-1盐酸奥布卡因(倍诺喜，日本参天制药株式会社)；改良组织/细胞 RNA 快速提取试剂盒(山东思科捷科学仪器有限公司)；HiScript®ⅡQ RT SuperMix qPCR(+gDNA wiper)、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司)；BCA 蛋白浓度测定试剂盒(增强型，碧云天生物技术有限公司)；MMP-3 、TIMP-3、Col3α1 酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)。

1.1.2 实验动物与分组2周龄英国种三色短毛健康雄性豚鼠90只(丹阳市吕城镇奥臣实验动物养殖场)，体重(110±10)g，入组前对豚鼠眼部进行筛选检查，排除各种眼部疾患。随后采用随机数字表法将豚鼠分为正常对照(NC)组、透镜诱导型近视(LIM)组以及LIM+电针干预(LIM+EA)组，每组各30只。各组豚鼠均在饲养1周、2周和4周时给予相应的处理。其中，NC 组豚鼠不作任何干预，LIM组和LIM+EA组豚鼠右眼均配戴-6.00 D透镜作为造模眼，左眼不戴镜作为自身对照；LIM+EA组豚鼠在戴镜的同时给予电针刺激两侧太阳穴与合谷穴，每日上午900～1000电针干预30 min，波形为连续波，频率2 Hz，脉冲长度0.1 s。实验过程中保持饲养温度 20～26 ℃，自然照明环境下12 h/12 h 昼夜循环，并供给自由饮食。本研究经山东中医药大学附属眼科医院伦理委员会批准，并严格遵守视觉与眼科动物研究协会(ARVO)原则。

1.2 方法

1.2.1 各组豚鼠屈光度测量各组豚鼠于造模后 1周、2周和4周均进行屈光参数(近视屈光度)检查。检查前使用盐酸环喷托酯滴眼液滴入结膜囊内，共3次，每次 1滴，间隔5 min，滴眼30～45 min后进行屈光度检查，每眼至少测3次，并取其平均值作为实验结果。

1.2.2 各组豚鼠眼轴长度测量各组豚鼠于造模后1周、2周和4周均应用眼科A型超声仪进行眼轴长度测量，测量前用盐酸奥布卡因滴眼2次，每次1滴。仪器参数设置参考Zhou等[6]所述参数:前房传播速度为1557 m·s-1，晶状体传播速度为1723 m·s-1，玻璃体传播速度为1540 m·s-1。测量前首先将探头用酒精棉片擦拭消毒，然后将探头垂直轻触于角膜顶点处，连续测量10次，剔除偏大偏小误差值后取平均值，整个过程中由同一位可熟练操作的视光师完成。

1.2.3 各组豚鼠行组织病理学染色观察睫状肌形态各组豚鼠造模后1周、2周和4周分别随机取3只豚鼠，100 g·L-1水合氯醛腹腔注射麻醉处死，摘取每只豚鼠造模眼在无菌生理盐水中进行简单冲洗并剔除眼周组织，立即置于眼球固定液中固定24 h，然后进行常规脱水、石蜡包埋、切片，进行苏木精-伊红(HE)染色，观察每只豚鼠造模眼睫状肌的生理形态结构变化。

1.2.4 q-PCR检测各组豚鼠睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的mRNA表达造模后1周、2周和4周，各组随机选取3只豚鼠腹腔过量注射100 g·L-1水合氯醛麻醉处死，迅速摘取造模眼眼球，解剖分离出睫状肌，液氮速冻，-80 ℃保存备用。选用改良组织/细胞RNA快速提取试剂盒提取睫状肌组织总RNA，然后进行逆转录合成cDNA，采用q-PCR检测各组豚鼠睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的mRNA表达。应用DNAStar软件进行各基因引物序列的设计，其中MMP-3上游引物:5’-CTGGGCCTGGGATTAATGGAGACG-3’，下游引物:5’-CAGCAGGAGAGGCAGGAGGAGGAC-3’，大小为255 bp；TIMP-3上游引物:5’-GCATCCGGCAGAAGGGTGGCTACT-3’，下游引物:5’-AGGGGTCTGTGGCGTTGATGA-3’，大小为84 bp；Col3α1上游引物:5’-GACCCCAAGGCCCCAAAGGAGAT-3’，下游引物:5’-AGGGGCACCAGGATGACCAGACG-3’，大小为272 bp；GAPDH 作为内参基因，上游引物:5’-CTGACCTGCCGCCTGGAGAAACC-3’，下游引物:5’-ATGCCAGCCCCAGCGTCAAAAGT-3’，大小为170 bp。采用2-△△Ct方法对各组豚鼠睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 的mRNA相对表达量进行定量分析。

1.2.5 ELISA法检测各组豚鼠睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的蛋白表达造模后1周、2周和4周，各组随机选取4只豚鼠并分离其造模眼睫状肌组织，按质量体积比(10 mg100 μL)加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA缓冲裂解液，电动匀浆充分研磨，5000 r·min-1离心5 min，取上清进行超声破碎，5000 r·min-1离心5 min后取上清，用BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)测定各组豚鼠睫状肌组织溶液中的总蛋白浓度，应用ELISA试剂盒检测MMP-3、TIMP-3和Col3α1的蛋白相对表达水平。

2 结果

2.1 各组豚鼠屈光度和眼轴长度变化造模后1周、2周和4周，与NC组相比，LIM组豚鼠造模眼与自身对照眼近视屈光度和眼轴长度的差值均显著增加(均为P<0.001)；与LIM组相比，LIM+EA组豚鼠造模眼与自身对照眼近视屈光度和眼轴长度的差值均减小(均为P<0.05)(见表1)。

表1 造模后1周、2周、4周各组豚鼠屈光度和眼轴长度比较

2.2 各组豚鼠睫状肌HE染色结果各组豚鼠睫状肌HE染色结果显示，NC组豚鼠睫状肌纤维排列

紧密，均匀有序；LIM组豚鼠睫状肌纤维排列松散混乱，有机纤维溶解断裂；LIM+EA组豚鼠睫状肌纤维排列较LIM组更为有序，相对完整。另外，随着造模时间推移，LIM组豚鼠睫状肌纤维排列愈加松散，断裂溶解更加明显；LIM+EA组豚鼠睫状肌纤维排列虽仍然紊乱，但与LIM组相比，睫状肌纤维排列紊乱情况有明显改善(见图1)。

图1 造模后1周、2周和4周各组豚鼠睫状肌HE染色结果

2.3 各组豚鼠睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的mRNA表达造模后1周和2周，LIM组豚鼠造模眼睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 mRNA 的相对表达水平与 NC组相比均明显升高(均为P<0.01)，LIM+EA组豚鼠造模眼睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 mRNA的相对表达水平与LIM组相比均降低(均为P<0.05)。造模后4周，LIM组豚鼠造模眼睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 mRNA的相对表达水平与 NC组相比均降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，LIM+EA组豚鼠造模眼睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 mRNA的相对表达水平与LIM组相比均明显升高，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(见表2)。

表2 造模后1周、2周和4周各组豚鼠睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 mRNA相对表达水平

2.4 各组豚鼠睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的蛋白表达造模后1周和2周，LIM 组豚鼠造模眼睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的蛋白相对表达水平与NC组相比均明显升高(均为P<0.05)，LIM+EA组豚鼠造模眼睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的蛋白相对表达水平与LIM组相比均降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。造模后4周，LIM组豚鼠造模眼睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 的蛋白表达相对水平与 NC组相比均降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，LIM+EA组豚鼠造模眼睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的蛋白表达水平与LIM组相比均明显升高，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(见表3)。

表3 造模后1周、2周和4周各组豚鼠睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的蛋白表达

3 讨论

有证据表明，近视的发生率与近距离工作和阅读行为有关[7]。Vasudevan等[8]研究发现，早发性近视和晚发性近视比正视眼更容易产生因近距离工作诱发的短暂性近视，且长时间近距离工作可造成睫状肌的持续收缩引起调节痉挛[9]。此外，近视儿童的睫状肌体积大于非近视儿童，表明睫状肌可能参与了屈光不正的发展[10]。本实验所使用的透镜诱导型近视豚鼠不仅可模拟人眼在近距离工作中近视的发生发展，为探讨近视发生发展中睫状肌ECM中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的异常变化提供良好的模型支撑，而且可为临床应用电针干预防治近视作用机制提供一定的理论依据。

MMP主要参与细胞增殖、迁移和分化，ECM重塑以及组织浸润和血管形成。TIMP作为一种内源性组织抑制剂可以调节MMP的表达，并且MMP/TIMP比值通常决定ECM蛋白降解和组织重塑的程度[11]。组织重塑主要涉及ECM的合成和降解，其中MMP-3可降解ECM的各种蛋白多糖成分以及纤连蛋白、层粘连蛋白和明胶[12-13]。有研究发现，MMP-3的活性可能主要受TIMP-3高活性的抑制[14]。因此，TIMP-3作为MMP-3的抑制剂，其表达水平应与MMP-3成反比。Col3α1主要参与细胞黏附、迁移、增殖和分化，且在许多纤维化疾病，如肾纤维化、肝纤维化和系统性硬化症中，其含量增加，形成更纤细的原纤维[15]。在本研究中，造模后1周和2周LIM组和LIM+EA组豚鼠睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的表达均上调，与Jia等[16]研究结果相一致，即在近视(屈光度<-6.00 D)稳定期患者的眼球标本房水中MMP-3和TIMP-3水平升高。根据动态平衡假说，TIMP表达水平的升高反映了一种细胞代偿反应，即为抵消和限制因MMP水平升高引起ECM的强烈降解致使TIMP的表达代偿性增加[17]。因此，本研究中TIMP-3表达量增加可能是对近视豚鼠睫状肌异常变化的代偿性反应。此外，研究还发现，造模后1周和2周，LIM+EA组豚鼠睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的表达均低于LIM组，提示电针干预近视豚鼠可影响睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的表达，从而延缓近视的发生、发展。上述结果提示，在近视的发生发展中，MMP-3、TIMP-3和Col3α1的异常表达可能改变了睫状肌的形态结构，进而影响睫状肌的生理功能。

纤维化主要表现为损伤部位的成纤维细胞迁移、增殖以及ECM(包括胶原I、II、III、IV等)的沉积，常见于各种器官，包括心脏、肝、肺和肾脏[18]。纤维化主要包括四个阶段，其中前3个阶段分别为原发性组织损伤(第一阶段)、激活效应细胞(第二阶段)和产生ECM (第三阶段)，在第四阶段中，ECM的动态沉积和清除不充分导致纤维化增加，最终导致器官功能衰竭[19]。在某些病理因素的影响下，眼内组织也可发生纤维化病变，如角膜纤维化、结膜纤维化、视网膜纤维化和巩膜纤维化[20-22]。有研究结果表明，在纤维化动物模型中，其建立的纤维化可能会消退，可能与存在去除ECM沉积的内源性机制有关[23]。还有研究表明，MMP-3、TIMP-3和Col3α1等细胞因子参与了肺纤维化及肝纤维化疾病的发生发展[24-26]。在近视的发展过程中，ECM的丢失可能导致巩膜重塑和眼轴增长[27]。本研究结果显示，造模后4周LIM组近视豚鼠睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 mRNA和蛋白的相对表达水平均明显下调且低于NC组，因此推测随着近视度数的增加，睫状肌形态结构发生病变，效应细胞活性下降，细胞合成细胞因子的功能受阻，相关细胞因子表达水平相应降低，进而导致睫状肌正常的调节功能受阻，并逐渐导致睫状肌功能受到抑制；而造模后4周，LIM+EA组豚鼠睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的mRNA和蛋白的相对表达水平均高于LIM组，推测电针干预可恢复受损的睫状肌细胞的生理功能，促进相关细胞因子的表达，进而改善睫状肌组织的局部微环境，并影响睫状肌组织的重塑过程，从而延缓近视的发生、发展。

综上所述，睫状肌形态与功能的异常变化可影响近视的发生、发展，在近视发展初期，透镜诱导型近视豚鼠睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1表达水平的上调可能导致睫状肌发生纤维化病变，致使睫状肌组织发生不同程度的重塑；电针干预可使透镜诱导型近视豚鼠近视屈光度和眼轴长度增长减缓，且显著下调睫状肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的表达，影响睫状肌组织的重塑过程，从而在近视治疗中发挥一定的作用。但电针干预治疗近视的具体作用机制尚不明了，还需进一步研究及探索。