10种天然产物抗茶轮斑病的生物活性

饶家瑞，雷志伟，周玉锋

(贵州省农业科学院 茶叶研究所， 贵州 贵阳 550006)

0 引言

【研究意义】茶叶是人们喜爱的饮品，并具有一定的保健和药用价值[1-2]。贵州种茶历史悠久[3]，并为贵州的经济发展做出了一定贡献。茶叶品质是贵州茶产业发展的生命线，也是抢占国内外茶市场的核心指标。近年来，随着茶产业的不断发展，贵州茶树病害加重，尤以茶轮斑病危害较重[4]，而安全绿色农药的合理利用是防治茶树病害和确保茶叶安全生产的重要措施[5-6]。因此，从天然产物中寻找对环境友好的抗茶轮斑病绿色农药，对贵州茶产业的健康发展具有重要意义。【前人研究进展】前人对不同农作物不同病害的绿色农药应用及合成进行了诸多研究[7-9]，姚亚丽等[7]研究显示，中生菌素具有广谱抑菌活性，对茶叶病害具有一定的抑制作用；YOSHIKAWA等[8]研究表明，萎锈灵对植物真菌病害有一定防治效果；WANG等[9]采用二元活性拼接法，用水杨醛和不同取代基苯丙炔构建系列化合物，并从中鉴定出化合物1a抗菌核病、苹果树腐烂病菌和灰葡萄孢菌的生物活性优于对照药物百菌清。【研究切入点】虽然作物生产上已应用的中生菌素、萎锈灵等高效低毒农药比一般农药[10-11]的用量更小，残留更低，但随着作物病害耐药性的增强及其病害严重情况下的超量施用，已造成农药残留超标和环境污染问题，进而也影响贵州茶叶品质和产量的提高。目前除少数植物源天然产物农药(如除虫菊酯)外，多数均是对其化学结构进行修饰改性后的产物，虽具有较高的抗菌活性，但是部分农药残留仍是一个难题。自然界的诸多植物均具有抗菌消炎作用，从中提取的天然产物除具有杀菌作用外，还可被植物自身很好降解，同时解决农药残留问题。因此，从天然产物中筛选高活性农药应用于茶叶生产意义重大。【拟解决的关键问题】在天然产物中，从其化学结构含有醛基[12]、酚类[13]和多羟基[14-15]基团的物质中筛选到具有较高生物抗菌活性的可能性较大。因此，选择含有以上化学结构的10种天然产物筛选抗茶轮斑病的生物活性，并利用扫描电子显微镜(SEM)探寻活性最优天然产物潜在的抗茶轮斑病活性机制，以期寻找天然产物中具有抗茶轮斑病活性的化合物，为降低茶叶农药残留和提高贵州茶叶品质提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 茶轮斑病菌 茶轮斑病菌是采用单孢分离法结合形态学与分子生物学鉴定方法分离鉴定所得菌株，测序结果为拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)的Pestalotiopsissydowiana病菌[16-17]，由贵州省农业科学院茶叶研究所提供。

1.1.2 药剂 10种天然产物的名称、结构式及来源见表1。其中，香草醛、丁香醛、愈创木酚和百里香酚购于上海阿拉丁试剂有限公司，吲哚购于上海九鼎化学有限公司，槲皮素、香叶木素和芹菜素购于上海麦克林有限公司，肉桂酸和L-薄荷购于上海乐研试剂有限公司。98%萎锈灵购于上海麦克林有限公司，无水乙醇购于天津市富宇精细化工有限公司，吐温-80购于天津市大茂化学试剂厂，土豆培养基(PDA)购于广东环凯微生物科技有限公司。其他试剂均购于上海安耐吉化学试剂有限公司。通过Sarfori-us型电子天平(精度0.0010 g)完成药品称量。

表1 10种天然产物的名称、结构式及来源

1.1.3 仪器 Nova NanoSEM 450扫描电子显微镜，超净工作台(苏净集团安泰公司)，电热鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)，恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)，高温蒸汽灭菌锅(上海沉汇仪器有限公司)，BHC-1300II A/B3生物洁净安全柜，Mill-Q型超纯水制备仪；20～200 μL、100～1000 μL和1～5 mL移液枪，电子天平。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 试验共设12个处理，按天然产物相应编号分设10个处理；处理11，阳性对照(CK1)，萎锈灵农药；处理12，空白对照(CK2)，等量二甲基亚砜(DMSO)吐温水。3次重复，随机排列。

1.2.2 抗茶轮斑病的生物活性初筛

1) 培养基的配制。称取 800 g去皮土豆放入4.5 L清水中，熬煮后滤去土豆残渣，加入80 g琼脂、80 g葡萄糖、12 g磷酸二氢钾、6.0 g硫酸镁和40 mg维生素B1，混匀溶解后以每瓶 90 mL转移到 250 mL锥形瓶中，封口后在 121℃条件下高压灭菌 20 min，冷却后得PDA培养基备用。马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB) 参照HOU等[18]的方法配制。

2) 药液配制。称取各待测天然产物 10 mg分别溶解到 0.5 mL DMSO中，后转移至含4.5 mL无菌吐温水的15 mL离心管中，再将其加入制备好的45 mL PDA培养基中，混匀，得到天然产物的最终浓度为100 μg/mL。将含有各种待测天然产物的培养基分别平均倒入3个培养皿中冷却备用。

3) 抗茶轮斑病抑制率的测定。采用菌丝生长速率法[19]测定10种天然产物对茶轮斑病的抑制率。先在提前活化好的病菌边缘打孔制取直径为 4.0 mm的菌饼，再用无菌接种针将菌饼接种到PDA培养基上，置于 28℃的恒温培养箱中培养 5 d，空白对照组菌落长到 6.0 cm左右时，采用十字交叉法用直尺测量菌落直径，计算其抑制率。

抑制率=[(对照组净菌落直径-处理组净菌落直径)/对照组净菌落直径]× 100%

1.2.3 抗茶轮斑病EC50的测定 根据10种天然产物抗茶轮斑病活性的初筛结果，先将活性较好各待测天然产物配置成浓度为100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL和6.75 μg/mL的5梯度药液，并采用菌丝生长速率法测定对应茶轮斑病菌的抑菌活性，用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率，并以天然产物浓度的对数为自变量(x)，相对抑制率为因变量(y)，拟合活性较好天然产物对茶轮斑病的线性回归方程，计算各天然产物的抑制率、抑制中质量浓度(EC50)及相关系数(R)。根据EC50判断天然产物的毒力大小，即天然产物的EC50越小，其对茶轮斑病菌的毒力越强。

1.2.4 对茶轮斑病菌细胞外壁损伤程度的观察 用RAO等[20]稍加修改的电镜制样方法，采用扫描电子显微镜观察筛选出的高活性天然产物作用于茶轮斑病，然后观察病菌细胞外壁的损伤程度。

先将茶轮斑病菌接种到PDA培养基上，25℃暗箱培养7 d。用打孔器从 PDA培养基边缘生长旺盛部位打孔，取菌饼接种到马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)中，25℃、180 r/min摇床暗箱培养7 d。取1 mL长满菌丝的PDB培养基于1.5 mL离心管中离心，然后用PBS缓冲液(pH 7.2)洗涤，以获得悬浮在PBS缓冲液中的菌丝。用200 μg/mL和500 μg/mL浓度的天然产物在DMSO中于震荡条件下处理茶轮斑病菌丝6～8 h，用PBS冲洗菌丝3次，再用适量2.5%戊二醛在4℃固定8 h，然后依次用适量乙醇和叔丁醇处理10 min。冷冻干燥和镀金后，样品在Nova NanoSEM 450扫描电子显微镜下成像，观察药物作用后真菌细胞外壁的损伤程度。

1.3 数据处理

采用Excel 2010和DPS对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 10种天然产物对茶轮斑病菌的抑制率

由图1看出，在100 μg/mL浓度下，茶轮斑病菌在10种天然产物药液中均能生长。由表2可知，菌落直径为CK2>处理6>处理8>处理10>处理7>处理1>处理9>CK1>处理2>处理5>处理3>处理4。除空白对照(CK2)外，以处理6的菌落生长最快，培养5 d菌落的直径为7.0 cm；处理4最慢，为1.3 cm；菌落直径小于阳性对照(CK1)的有处理2～处理5。10种天然产物对茶轮斑病菌的抑制率以处理4最高，为82.67%，较CK1增加48百分点；处理3其次，为65.33%，较CK1增加30.66百分点；处理5第3，为57.33%，较CK1增加22.66百分点；处理2第4，为42.67%，较CK1增加8百分点，且均极显著高于CK1。其余6个处理的抑制率均极显著低于CK1。说明，百里香酚、愈创木酚、吲哚和丁香醛4种天然产物抗茶轮斑病的活性均较好，并以百里香酚的抗菌活性最强。

表2 在100 μg/mL浓度下10种天然产物对茶轮斑病菌的抑制率

注：a为香草醛，b为丁香醛，c为愈创木酚，d为百里香酚，e为吲哚，f为槲皮素，g为香叶木素，h为芹菜素，i为肉桂酸，j为L-薄荷醇，CK1为阳性对照萎锈灵，CK2为空白对照。

2.2 3种活性较高天然产物对茶轮斑病的毒力强度

2.2.1 毒力回归方程 通过拟合得到百里香酚、愈创木酚和吲哚3种天然产物对茶轮斑病病原菌的毒力方程 (表3)：y愈创木酚= 1.517 7x+ 2.335 5(R=0.981 2)，y百里香酚= 1.731 6x+2.352 8(R=0.965 0)，y吲哚= 1.934 3x+ 1.368 4(R=0.958 9)，相关系数均>0.95，表明3种天然产物药剂浓度与抑制率间均存在良好的线性关系。

2.2.2 毒力强度 从表3可知，3种天然产物的EC50为33.79～75.42 μg/mL。其中，以百里香酚对茶轮班病的毒力强度最大，EC50为33.79 μg/mL；愈创木酚其次，EC50为56.97 μg/mL；吲哚第3，EC50为75.42 μg/mL。

表3 3 种天然产物对茶轮斑病病原菌的毒力回归方程及EC50

3种天然产物的EC50用药量依次比CK1减少197.73 μg/mL、174.55 μg/mL和156.10 μg/mL。表明，3种天然产物抗茶轮斑病的效果均较好。

2.3 百里香酚处理茶轮斑病真菌细胞外壁的损伤情况

由图2看出，百里香酚浓度为200 μg/mL处理茶轮斑病菌，可导致其表面形态从光滑圆润变为部分裂开(图2-a)，并可见孔状形状 (图2-b)；当处理浓度为500 μg/mL时，其细胞壁损坏的程度更加明显，许多细胞破裂 (图2-c)。表明，百里香酚引起了病菌细胞体系列生理变化，并导致其细胞受损死亡。

3 讨论

茶轮斑病(Pestalotiopsistrachicarpicola)又称为茶梢枯死病，是贵州茶树叶部的主要病害之一[21-22]，其病原菌存在多样性，包括山茶花拟盘多毛孢 (Pestalotiopsiscamelliae)、茶假拟盘多毛孢(Pseudopestalotiopsiscamelliae-sinensis)和新拟盘多毛孢(Neopestalotiopsisclavispora)[23-24]，该病害是致使茶叶品质和产量下降的主要原因之一。张欣等[17]探明了茶轮斑病病原菌Pestalotiopsistrachicarpicola的生物学特性，为茶轮斑病防治药剂的筛选提供了参考。10种天然产物的化学结构中主要包含有苯环、环己烷和苯并杂环，并以苯环上连接异丙基、甲基和羟基等给电子基团的百里香酚抗茶轮斑病的生物活性最佳，EC50为33.79 μg/mL。因此，接下来的研究将以骨架结构为苯环，且取代基以供电子基为主的香芹醇和丁香酚等天然产物为目标，希望从中继续筛选出活性更高的抗茶轮斑病天然产物，为研发结构新颖的抗茶轮斑病绿色农药提供新的先导化合物。

4 结论

研究10种天然产物(香草醛、丁香醛、愈创木酚、百里香酚、吲哚、槲皮素、香叶木素、芹菜素、肉桂酸和L-薄荷)在100 μg/mL浓度下抗茶轮斑病的生物活性，结果显示，百里香酚、愈创木酚和吲哚对茶轮斑病的抑制率分别为82.67%、65.33%和57.33%，比阳性对照萎锈灵(34.67%)分别增加48百分点、30.66百分点和22.66百分点，差异均达极显著，其EC50分别为33.79 μg/mL、56.97 μg/mL和75.42 μg/mL，比阳性对照萎锈灵(231.52 μg/mL)的EC50剂量分别减少197.73 μg/mL、174.55 μg/mL和156.10 μg/mL。

通过高活性天然产物百里香酚作用于茶轮斑病后病菌细胞外壁的损伤程度观察显示，在200 μg/mL浓度时，百里香酚可导致茶轮班病真菌细胞壁的表面形态从光滑圆润变为部分裂开；在500 μg/mL浓度时，百里香酚真菌细胞壁的受损程度明显增加并导致其细胞死亡。因此，百里香酚可用于茶轮斑病的生物防治，其次可选择愈创木酚和吲哚，也能较好地防治茶轮斑病。