半夏厚朴汤治疗反流性食管炎的系统药理学分析

关永霞 申凤霞 李倩 范建伟 陈学通 王永华 张贵民

摘要 目的：采用系统药理学的方法探讨半夏厚朴汤治疗反流性食管炎的有效成分、作用靶点及作用机制，为其进一步开发和临床应用提供参考。方法：利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）和文献检索搜集半夏厚朴汤中的化学成分;运用口服生物利用度（OB）、类药性（DL）2个药代动力学参数筛选活性化合物;采用WES模型预测候选活性化合物的靶点;通过检索CTD数据库和TTD数据库，筛选出与反流性食管炎相关的靶点;GOBP富集分析;构建化合物-靶点、靶点-通路网络图。结果：构建了一个包括521个化合物的半夏厚朴汤分子数据库，通过OB、DL筛选获得65个候选活性化合物，WES模型预测出候选活性化合物的249个靶点;筛选出151个与反流性食管炎相关的靶点;GOBP富集分析得到与反流性食管炎相关的生物过程条目20个;KEGG通路富集筛选得到相关的通路11条。结论：半夏厚朴汤主要通过调控炎症、调节胃肠动力、保护胃黏膜、提高免疫力、调节胆碱能神经等来治疗反流性食管炎，半夏厚朴汤治疗反流性食管炎具有多成分、多靶点、多通路协同作用的特点，有望对反流性食管炎的治疗提供新的研究思路，为后期实验验证提供理论依据。

关键词 半夏厚朴汤;反流性食管炎;系统药理学;作用机制;靶点预测

Abstract Objective：To identify the active components，action targets and action mechanisms of Banxia Houpo Decoction in the treatment of reflux esophagitis by using systems pharmacology method，thus providing references for its further development and clinical application.Methods：Using the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology （TCMSP） database and literature search，the chemical components of Banxia Houpo Decoction was collected;then OB and DL pharmacokinetic parameters was applied to screen the active compounds;WES model was used to predict the target of candidate active compounds;by searching the CTD database and the TTD database，the targets related to reflux esophagitis were screened out，and were used for GOBP and pathway enrichment analysis;finally，the compound-target，target-pathway networks were constructed.Results：A molecular database of Banxia Houpo Decoction consisting of 521 compounds was constructed，and 65 active compounds were obtained by OB and DL screening.The WES model predicted 249 targets for the active compounds;and 151 of them were screened out as reflux esophagus Inflammation-related targets.GOBP enrichment analysis of these targets yields 20 items of biological processes related to reflux esophagitis;there were 11 signal pathways in KEGG pathway enrichment screening.Conclusion：Banxia Houpo Decoction mainly treats reflux esophagitis by regulating inflammation，modulating gastrointestinal motility，protecting gastric mucosa，improving immunity，and regulating cholinergic nerves etc.Banxia Houpo Decoction treatmenting reflux esophagitis has the characteristics of multi-component，multi-target，and multi-path synergy，which is expected to provide new research ideas for the treatment of reflux esophagitis and provide theoretical basis for later experimental verification.

Keywords Banxia Houpo Decoction; Reflux esophagitis; System pharmacology; Action mechanism; Target prediction

中圖分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.13.007

反流性食管炎（Reflux Esophagitis，RE）是指胃、十二指肠内容物反流入食管内所引起的一类消化系统常见病[1]，主要临床表现为烧心、反流、嗳气、呕吐、胸痛等[2-3]。近几年来，RE的发病率逐渐增高且治疗周期长，严重影响了患者的生命质量，目前西医治疗RE主要以降低胃酸、促进胃动力药为主[4]，但是现代研究发现停药半年后的RE与症状复发率分别为80%、90%[5]，如果得不到有效的治疗可能导致严重的并发症，如：溃疡、出血等，甚至发展为癌症[6]。

半夏厚朴汤[7]源自东汉张仲景的《金匮要略》，由半夏、厚朴、茯苓、生姜、紫苏叶组成，原典记载“妇人咽中如有炙脔，半夏厚朴汤主之”，具有行气散结、降逆化痰之功效，主要用于治疗“梅核气”。现代医学研究表明，半夏厚朴汤在治疗RE方面也有很好的药理学作用[8-11]，且具有较少的不良反应和较高的安全性;虽然半夏厚朴汤在治疗RE方面取得了一定的成效，但是其治疗RE的作用机制尚不明確，因此限制了该经方的使用和推广。

系统药理学是从分子、网络、细胞、组织、器官等不同水平上研究药物治疗疾病时对机体功能影响的一门新兴学科，是借助计算机技术来计算化合物的药代动力学参数、预测化合物靶点等，进而来阐述化合物、靶点、通路、器官等之间的相互作用关系。中药方剂成分多、靶点多，采用传统的实验方法分析起来费时费力，进而影响了中药现代化研究的发展，然而系统药理学对方剂的研究提供了新的理论方法和研究思路[12]。本研究运用系统药理学的方法对半夏厚朴汤治疗RE作用机制进行分析，将有助于对中药作用机制的探索，对新药开发提供新的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 半夏厚朴汤分子数据库的建立以及候选活性化合物的筛选

通过利用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）和文献检索搜集这5种草药所含有的化合物[13]。口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）是指口服药物产生疗效的分子占口服总量的百分比，类药性（Drug-likeness，DL）是指候选化合物与已知药效分子的相似性，这2个指标都是筛选有效药物成分的重要指标，因此本研究选择OB≥30%和DL≥0.18的化合物作为候选活性化合物[14-15]。

1.2 靶点的预测与筛选

采用加权系综相似度（Weighted Ensemble Similarity，WES）模型来预测该经方的靶点[16]。WES模型的基本流程如下：1）在整体框架中确定与药理特性高度相关的关键配体结构特征;2）通过评估整体相似性而不是通过单个配体判断来确定药物与靶标的隶属关系;3）利用贝叶斯网络标准化的系综相似度得分（Z-score），得到最终的预测结果，WES模型的外部测试和实验评价的准确性分别为70%和71%，这表明该模型为药物靶点的预测提供了一种潜在的数学模型，因此也证明了该模型的可靠性。

RE相关靶点的筛选利用的是比较毒物遗传学数据库（Comparative Toxicogenomics Database，CTD）和疗效药靶数据库（Therapeutic Target Database，TTD），CTD数据库是一个强大的公开数据库，它提供有关基因与疾病之间的相互关系;TTD数据库中的靶点是通过临床试验或有关研究药物治疗靶点的专利、文献报告得到的[17-18]。将WES预测的候选化合物的全部靶点分别导入CTD和TTD数据库，筛选出与RE相关的靶点。

1.3 GOBP富集分析

基因本体论（Gene Ontology，GO）是一个标准化的基因功能分类系统，由3部分组成，分别是参与的生物过程（Biological Process）、细胞成分（Cellular Component）和基因的分子功能（Molecular Function）[19]。DAVID数据库为研究人员提供了一套全面的功能注释工具，有助于我们了解大量基因背后的生物学含义。我们将上一步骤中筛选得到的靶点导入到DAVID数据库[20]（https：//david.ncifcrf.gov/）中对其GOBP进行富集分析。靶点导入数据库后，将会得到这些靶点参与的生物过程，选择P-Value小于0.05的生物过程进行分析。候选活性化合物经过口服后，作用于人体内的靶点蛋白，参与的生物过程各不相同，因此为了探究前面筛选得到的151个靶点参与了生物体内的哪些生物过程来参与RE的治疗，我们将靶点导入到DAVID数据库进行GOBP富集分析，富集结果被绘制成柱状图。

1.4 网络构建与分析

半夏厚朴汤中的候选活性化合物可以同时与多个靶点相互作用，同一靶点也可以受多个成分的同时干扰，为了更清晰地描述候选活性化合物与靶点之间的关系，我们绘制了化合物-靶点网络图。网络图的绘制及编辑使用Cytoscape软件[21]。为了更突出该方剂的核心候选活性化合物和靶点，我们借助了化合物-靶点网络中的节点的度这个参数，节点的度（指和该节点相关联的边的数目）是网络的基本属性[22]。Cytoscape是网络生物学分析和可视化最常用的工具，是用于探索由蛋白质、基因和其他类型的相互作用组成的生物医学网络的开放源代码软件。

2 结果

2.1 半夏厚朴汤分子数据库的建立以及候选活性化合物的筛选

利用TCMSP搜索和文献检索建立了由521个化合物组成的半夏厚朴汤分子数据库，其中符合OB≥30%且DL≥0.18的化合物有65种，占全部成分的13%，其中大部分候选活性化合物已被证实具有药理学作用，也间接证明了选用的WES模型的可靠性。

2.2 靶点的预测与筛选

通过WES模型的预测，一共得到65个候选活性化合物的249个靶点，为了解析半夏厚朴汤治疗RE疾病的作用机制，我们通过CTD和TTD数据库的筛选得到了151个与RE疾病相关的靶点。

2.3 GOBP富集分析结果 图中纵坐标表示GOBP富集的20个条目，横坐标表示每个条目所对应的P-value（P-value≤0.05）。从图中我们可以看出，大部分靶点参与的生物过程与RE息息相关。其中包括对药物的反应、炎症反应、钙离子介导的信号转导、花生四烯酸代谢过程、一氧化氮的生物合成过程的正调控、调节细胞增殖、T细胞活化等，这些靶点通过参与调控炎症反应、提高免疫能力、抑制细胞的异常增殖等来缓解或者治疗RE。见图1。

2.4 化合物-靶点网络图分析结果 图2中共有216个节点（其中候选活性化合物65个，靶点151个），1 022个对应关系，蓝色圆形代表候选活性化合物，红色方形代表靶点，边代表化合物与靶点之间的相互作用关系。分析图2表明，每个化合物平均与16个靶点相互作用，每个靶点平均与7个化合物相互作用，这一数据表明了半夏厚朴汤具有多成分、多靶点的作用特点。

2.5 化合物-通路网络图分析结果 图3中共有113个节点（靶点102个，通路11个）和156对靶点-通路互作关系。图中涉及到的信号通路主要有：代谢通路、神经活性配体-受体相互作用、钙离子信号通路、花生四烯酸代谢、胃酸分泌、TNF信号通路、趋化因子信号通路、P53信号通路等。

3 讨论

在本研究中，首先通过利用TCMSP数据库和文献挖掘构建了包含521个分子的半夏厚朴汤分子数据库，从中筛选出65个候选活性成分;借助WES预测出活性化合物的524个靶点，通过CTD和TTD数据库的筛选得到了151个与RE相关的靶点，然后对靶点进行了GOBP富集分析，富集结果显示，大部分靶点参与的生物过程与RE密切相关，如：对药物的反应、炎症反应、钙离子介导的信号转导、花生四烯酸代谢过程、一氧化氮的生物合成过程的正调控、调节细胞增殖、T细胞活化等。

然后，我们构建了化合物-靶点网络图，该图中化合物和靶点的平均的度分别为16、7，这一数据验证了中药多成分、多靶点的特点;化合物-靶点网络分析结果显示半夏厚朴汤中的一些重要成分如琥珀酸、厚朴酚（Magnolol）和厚朴酚（Honokiol）等对RE的治疗有着良好的效果。并且通过分析该网络图可以得知促进胃黏膜中PTGS1和PTGS2的表达可以催化花生四烯酸产生PGE2和PGI2，PGE2和PGI2可以抑制胃酸的分泌;抑制PPARG的活性起到抗炎作用，对RE的治疗也有一定的疗效。表明了此方剂是通过多成分、多靶点协同来治疗RE。

随后，分析靶点-通路网络图可以看出，半夏厚朴汤的靶点主要映射在以下通路上：代谢通路、神经活性配体-受体相互作用、钙离子信号通路、花生四烯酸代谢、胃酸分泌、TNF信号通路、趋化因子信号通路、P53信号通路等。这些通路可能是该经方治疗RE的重要通路，通过在不同的通路中产生协同叠加的作用，进而起到治疗RE的目的。

琥珀酸（Succinic Acid，MOL01）是半夏中的主要成分且与24个靶点有相互作用，Rubic等[23]的研究发现琥珀酸可以触发细胞内钙动员，诱导迁移反应，并与Toll样受体配体协同作用，产生炎症介质;琥珀酸还可以增强树突状细胞介导的T细胞活化，通过作用于树突状细胞激活的早期步骤而增强T细胞反应，进而通过发挥抗炎作用和提高免疫来缓解RE疾病。厚朴中厚朴酚（Magnolol，MOL23，Degree=25）和厚朴酚（Honokiol，MOL24，Degree=28）是厚朴里主要研究的活性成分，Zhang等[24]的实验结果表明，厚朴酚（Magnolol）和厚朴酚（Honokiol）对乙酰胆碱和5-羟色胺处理的大鼠离体胃底肌条收缩有明显的抑制作用，在他们的研究中厚朴酚（Magnolol）和厚朴酚（Honokiol）可以阻止钙通过电位依赖性钙离子通道（Potential Dependent Ca2+ Channels，PDC）的跨膜流入，抑制平滑肌的收缩，并缓解平滑肌的痉挛;厚朴酚（Magnolol）和厚朴酚（Honokiol）还可以显著降低小鼠体内核素的残留率，并提高小鼠半固体营养餐的肠道推进比，并且它们与西沙必利之间没有显著差异;这进一步证明了这2个活性成分可能是通过促进胃肠动力来发挥治疗RE疾病的药理学作用。徐静华等[25]研究研究了6-姜酚（6-Gingerol，MOL53）、8-姜酚（8-Gingerol，MOL55）、10-姜酚（10-Gingerol，MOL52）、姜酮（Zingerone，MOL56）及姜烯酚（Shogaol，MOL10）这5种化合物的混合物（6-姜酚约占53%，8-姜酚约占13%，10-姜酚约占30%，姜酮和姜烯酚低于1%）对胃溃疡的影响，实验采用的幽门结扎法致溃疡模型，實验结果显示混合物组小鼠胃溃疡指数显著低于阿司匹林模型组，5种化合物混合物能显著增加胃黏液的分泌，增强胃黏膜自身防御因子水平，起到抗损伤的作用。这些数据都表明半夏厚朴汤各个成分之间相互协同作用来治疗RE疾病。

胃黏膜中PTGS1和PTGS2的表达可以催化花生四烯酸产生PGE2、PGI2和其他保护性因子[26]，PGE2和PGI2可以抑制胃酸的分泌，促进胃黏液和碳氢化合物的分泌，扩张血管，增加胃黏膜的血流量，并促进胃黏膜上皮细胞的更新和增殖[27]，因此，通过调节这2个靶点可以调控胃酸的分泌和胃黏膜的修复，进而有助于RE疾病的治疗。幽门螺杆菌阳性胃炎中NOS2表达显著增加[28]，NOS2的表达和活性可能导致高水平一氧化氮（NO）的产生，NO的高产量产生可能对组织炎症和伤害产生有害的影响，半夏厚朴汤可以作用于NOS2，通过调控NOS2的表达来减少炎症的发生进而控制RE。过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisome Proliferator-activated Receptor，PPAR）构成核激素受体超家族的重要子家族，已经鉴定出3种同工型，PPARα，PPARβ和PPARγ。PPARG（Degree=43）对炎症具有多种抑制作用，包括减少核因子κB转录活性，减少T淋巴细胞中炎症介质的产生，促进先天免疫系统中抗炎介质的表达，抑制巨噬细胞中炎症介质基因的编码[29]。在适应性免疫系统中，PPARG激活会降低树突状细胞对初始T淋巴细胞的免疫作用，并降低其与关键转录因子，活化T细胞的核因子相互作用的能力，减少了淋巴细胞中促炎分子的产生[30];在先天免疫系统的细胞中，PPARG激活可促进抗炎介质（包括IL-10和LXR）的表达，以及有助于选择性活化巨噬细胞的表型，对炎症发挥抑制作用[31]。所以，半夏厚朴汤可以通过调节这些靶点蛋白来达到治疗RE的目的。

同一个靶点可以参与不同的信号通路，在各条通路上可能通过发挥不同的作用来治疗疾病，不同的靶点也可以参与到同一条通路中发挥作用，体现了靶点治疗疾病的协同作用机制，这就是中药方剂的优势。为了进一步探究半夏厚朴汤治疗RE的作用机制，我们研究了候选活性化合物的靶点参与的信号通路对RE治疗的影响。我们将潜在药效靶点导入到DAVID数据库，导出靶点参与的生物学信号通路，然后筛选出可能与RE相关的11条生物通路，绘制了靶点-通路网络图。其中通过作用于神经活性的配体-受体相互作用信号通路可以激活胃肠道5-羟色胺4受体（5-HT4），进而刺激胃肠蠕动反射和肠道分泌，能够促进消化、对消化不良起到一定的治疗作用[32];钙离子信号通路和花生四烯酸代谢通路参与了炎症的调节[33];趋化因子信号通路在调控免疫中起重要作用[34];胃酸分泌通路则参与胃酸分泌的调节，使得胃酸分泌量适中，避免分泌过少导致腹胀消化不良，而分泌过多又导致溃疡、出血等并发症的发生[35]。这些信号通路通过候选活性化合物相互联系，也进一步证明了该方剂能在不同的信号通路中发挥协同作用。进而我们推测半夏厚朴汤通过作用于这些信号通路，从减少炎症、调节胃肠动力、保护胃黏膜、调节能量代谢、提高免疫力、调节胆碱能神经、抑制肿瘤细胞增殖等方面发挥治疗RE的作用。

总之，本研究提供了一种基于系统药理学，分别从分子、网络、通路层面来分析半夏厚朴汤治疗RE的新方法，解析了中药方剂的多成分、多靶点、多通路协同调节治疗RE的机制，证明了中药方剂的整体性作用机制;为中药方剂的研究提供了新的研究思路。后续将进行其相应的细胞实验和动物实验验证研究，进一步明确其发挥疗效的活性分子、作用靶点以及作用机制。

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（2020-05-18收稿 责任编辑：魏庆双，徐颖）