肺炎支原体肺炎患儿外周血白细胞自噬相关蛋白表达及临床意义*

侯雪 刘燕 杨晓丽 李静

(1.山西医科大学儿科医学系小儿内科教研室,山西 太原 030001； 2.山西省人民医院儿科,山西 太原 030012)

肺炎支原体(Mycoplasma Pneumoniae，MP)是引起儿童社区获得性肺炎(Community Acquired Pneumonia，CAP)的最常见病原体之一。近年来引起重症及难治性肺炎支原体肺炎病例(Refractory Mycoplasma Pneumoniae Pneumonia,RMPP)报道逐渐增多，故了解MP引起的肺炎支原体肺炎(Mycoplasma Pneumoniae Pneumonia，MPP)的发病机制越来越迫切。目前关于MPP致病的具体机制仍不明确，主要包括上皮黏附、毒素作用及免疫紊乱[1]。自噬是机体的一种稳态机制，通过溶酶体降解途径处理受损的细胞器、变性蛋白质以及侵入的病原体，是近些年发现具有防御病原菌的天然免疫和获得性免疫的新途径[2]。关于自噬与肺部感染性疾病如金黄色葡萄球菌、新型隐球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)和结核分枝杆菌感染[3-6]的一些体外和动物实验表明，自噬在肺部感染性疾病中具有十分重要的作用，但目前国内外尚缺乏自噬在MPP患儿外周血中的研究，且有关MPP患儿外周血白细胞自噬水平的研究国内外仍然缺乏。本研究通过检测MPP患儿外周血白细胞自噬相关蛋白LC3II/I比例、Beclin1表达量及细胞因子的表达量，分析自噬与细胞因子和不同程度MP的相关性，探讨自噬在MPP中所发挥的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1月～2020年5月山西省人民医院儿科病房收治的MPP患儿进行前瞻性分析。MPP感染急性期患儿50例，所有患儿诊断标准符合《诸福棠实用儿科学》MPP感染诊断标准[8]。依照病情将50例MPP患儿分为轻症组及重症组。重症组纳入标准[8]：在确诊MPP基础上出现以下任意一条表现：①明显气促或心动过速(根据不同年龄有不同评判标准)，伴或不伴呼吸困难(鼻翼搧动、呻吟、三凹征)及紫绀等。②低氧血症，吸入空气条件下，脉搏血氧饱和度(SaO2)≤0.92。③经大环内酯类抗菌药物正规治疗7 d及以上，临床征象加重、仍持续发热、肺部影像学加重。④胸部影像学表现为多叶段受累或受累面积≥2/3肺。⑤出现胸腔积液、肺不张、肺脓肿等肺内并发症。⑥合并其他系统严重损害(中枢神经系统感染、心力衰竭、心肌炎、消化道出血、明显电解质/酸碱平衡紊乱等)。家长自愿参与研究，签署同意书。排除其他疾病所致肺炎、严重器质性疾病、糖皮质激素或抗生素及免疫抑制剂服药史等患儿。其中轻症组28例，重症组22例。选取该院同期门诊体检的儿童在排除肺炎支原体近远期感染后认定为健康儿童25例为对照组。入选标准:①年龄1～12岁,性别不限。②近1月内无咳嗽、发热鼻塞、流涕等急性呼吸道症状,无呕吐、腹泻等消化道症状者。③无免疫缺陷性疾病，排除慢性疾病者。④患儿依从性好，能配合检查。本研究获得山西省人民医院伦理委员会批准，患儿监护人知情同意。

MPP轻症组28例，年龄3～12岁，平均(6.12±2.32)岁；重症组22例，年龄3～12岁，平均(7.06±1.91)岁；对照组25例，年龄3～12岁，平均(6.42±2.46)岁。3组受试对象性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 材料与方法

1.2.1 主要试剂及设备 LC3Ⅱ/I、 Beclin1的一抗及二抗(北京百奥菜博科科技有限公司)；白细胞介素6( Interleukin6，IL-6)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis Factor-α，TNF-α)、酶联免疫吸附( Enzyme Linked Immune Sorbent Assay，ELISA)试剂盒(伊来瑞特)；二喹啉甲酸蛋白检测试剂盒、增强型化学发光底物( Thermo Fisher公司，美国)。

1.2.2 标本采集及检测 轻症组、重症组在确诊时静脉抽取2 mL非抗凝静脉血，对照组则在清晨空腹抽取2 mL非抗凝静脉血，分离血清，置-20℃冰箱保存待测，标本采集前两周患儿无激素和免疫调节剂治疗史。其中1 mL检测细胞因子，1 mL分离并裂解白细胞检测 LC3Ⅱ、LC3I和 Bec1in1表达量,计算 LC3Ⅱ/I比例。 每组设置 3 个复孔,试验均重复 3 次取平均值。采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测患儿血清TNF-a、IL-6浓度，试验均重复3次取平均值。

1.3 统计学分析 数据采用SPSS 20.0统计软件进行分析，组间比较采用t检验；采用 Pearson相关性分析比较自噬水平和细胞因子之间的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血细胞LC3II/I比例及Beclin1表达量 MPP轻症组、重症组外周血白细胞中自噬相关蛋白LC3II/I及Beclin1表达量高于对照组，MPP重症组高于轻症组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1～2。

图1 3组白细胞中自噬相关蛋白LC3II/I表达情况

图2 3组白细胞中自噬相关蛋白Beclin1表达情况

2.2 血清细胞因子IL-6、TNF-α水平表达量 MPP轻症组、重症组IL-6、TNF-α水平高于对照组，MPP重症组IL-6、TNF-α水平高于轻症组，差异有统计学意义(均P<0.05)，见图3。

图3 3组外周血白细胞血清细胞因子表达水平

2.3 LC3II/I、 Beclin1及细胞因子的相关性 自噬相关蛋白LC3II/I、 Beclin1表达与IL-6、TNF-α成正相关(均P<0.05)，见表1。

表1 肺炎支原体患儿白细胞自噬相关蛋白和炎症指标的相关性

3 讨论

MP感染在儿童肺炎中占比约为20%～40%，且主要集中于5～9岁的群体，近年来MPP发病率逐渐上升[9]，重症肺炎支原体肺炎(Severe Mycoplasma Pneumoniae Pneumonia，SMPP)和RMPP在国内呈逐年升高的趋势，SMPP不仅可引起肺部实变、肺不张、胸腔积液、气胸等肺内并发症，还可导致多系统肺外并发症，病程长，病情重，甚至可引起多器官功能障碍综合征(Multiple Organ Dysfunction Syndrome，MODS)或多器官功能衰竭 (Multiple Organ Failure，MOF)，甚至死亡[10]。因此，临床对肺炎支原体病原学及免疫机制的研究也逐渐深入。迄今为止，MPP的发病机制尚不明确，随着研究的深入，目前已有免疫学发病机制、呼吸道上皮细胞吸附和MP直接侵入学说[1，11]。因此，研究MPP的发生发展机制是及时治疗MPP和降低SMPP患病率的关键。

自噬是真核细胞生物体在不断进化过程中形成的一个高度保守的过程，其参与多种生物学过程，自噬功能的改变影响老化和有缺陷的细胞器、蛋白聚集体以及入侵病原体的清除，它既能对抗外来病原微生物的入侵，又能保护细胞免受内毒物的损害[12]。有研究发现，自噬与很多疾病的发生密切相关，如神经退行性疾病、心血管疾病、克罗恩病、肿瘤及感染性疾病等[13-14]。一些动物实验表明，绵羊肺炎支原体(Mycoplasma Ovipneumoniae，MO)感染早期可通路激活巨噬细胞自噬，随着感染时间的延长，可通过调节PI3K通路抑制巨噬细胞的凋亡，利于MO在胞内的存活，利于避免被其它免疫细胞识别、清除[15]。MP可诱导炎症的发生，同时一些细胞内应激物也会诱导自噬的发生。自噬对胞内应激物的清除可以影响炎性小体装配，继而影响到炎症水平[16]。

自噬是由多种自噬相关基因 (Autophagy Related Gene, ATG)和受体信号分子通路调控的免疫过程[17]。Beclin-1和LC3作为自噬的标志性蛋白[18]，是实验中检测自噬作用最常用的蛋白，Beclin-1是最早被发现的多功能自噬蛋白之一，它可调节自噬性细胞死亡途径，与自噬体形成密切相关，对促进不同蛋白质之间相互作用起重要作用[19]。LC3是涉及自噬体形成的泛素样蛋白质, 它与酵母Atg8蛋白同源。LC3II定位于参与自噬途径的细胞膜上，其数量与自噬体形成程度相关，是很好的自噬体标记物[20]。在哺乳动物的自噬诱导时，磷脂酰乙醇胺(PE)修饰LC3-I转化为LC3-II是自噬体形成的关键步骤[21]。LC3II/I比例与自噬泡的数量成正相关，某种程度上反应细胞的自噬活性，比值越高，自噬活性越高[22]。本研究中细胞中LC3II/I、Beclin1表达均高于对照组，提示MPP患儿中性粒细胞中发生了自噬反应。

目前许多研究表明，多种细胞因子参与了MPP炎症反应过程，TNF-α、IL-6等细胞因子是调节细胞凋亡的重要细胞因子，若细胞因子在血清中表达出现失控，可直接导致细胞凋亡[9]。本研究中轻症组、重症组患儿血清中IL-6、TNF-α均高于对照组，表示IL-6、TNF-α参与了MPP炎症反应发生的过程，重症组患儿血清中IL-6、TNF-α高于轻症组，证明患儿病情越重，则血清中IL-6、TNF-α的含量越高，病情与炎症因子水平呈正相关，结合临床可作为MPP严重程度的指标及病情发展的参考。自噬在调节炎症介质中具有重要作用，并能够影响细胞中细胞因子的产生[23]，而在失调控的免疫反应中,大量的促炎因子和聚集的白细胞可以通过炎症信号通路诱导组织细胞内出现内质网应激,线粒体损伤,活性氧过量生成,诱发保护性自噬反应以包裹损伤的细胞器,限制损伤信号的进一步扩散。自噬被认为是机体调节免疫及对抗应激的重要防线。MPP发病重要机制之一是支原体脂蛋白诱导细胞凋亡，直接诱导细胞凋亡机制不明，间接诱导细胞凋亡是通过分泌相关细胞因子：TNF-α、IL-1、IL-6等发挥作用。若细胞因子在血清中的表达失控，则可直接引起细胞凋亡，而细胞凋亡与细胞自噬关系密切。

本研究中重症组自噬蛋白水平高于轻症组，表明自噬和病情程度有关，病情越重，自噬程度越高。同时IL-6、TNF-α与自噬蛋白成正相关，考虑可能是MPP中发生自噬会影响细胞因子的改变从而影响病情的轻重程度。推测通过测定自噬在不同程度MPP肺炎中的水平可对MPP的病情严重程度及预后做出评估。

4 结论

本研究结果显示，MPP患儿外周血白细胞自噬蛋白、炎症因子显著增加，提示自噬参与MPP的发病过程，细胞因子水平越高，炎症反应越明显，且自噬和细胞因子呈正相关，可能与MPP中发生自噬影响细胞因子的改变从而影响病情有关。目前，MPP细胞自噬处于基础研究阶段，自噬体和肺炎支原体互相作用的具体分子机制还有待进一步研究，今后仍需大量的基础和临床试验进行验证。