内质网应激反应对哮喘大鼠呼吸道黏膜上皮细胞黏蛋白5AC表达的作用机制*

陈家亮 周向东,2,3 李琪 钟有清 刘锋 陈小妹

(1.海南医学院第一附属医院呼吸内科，海南 海口 570102；2.急救与创伤研究教育部重点实验室，海南 海口 571199；3.中国医学科学院海岛急救医学创新单元，海南 海口 571199；4.海南医学院第一附属医院全科医学科，海南 海口 570102)

哮喘以气道高反应性、气道炎症、气道重塑为主要特征，表现为气道黏液过度分泌、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞过度浸润，导致肺功能下降[1-2]。哮喘病因复杂，多数患者接触过敏原后产生免疫反应，继而引起气道变异性炎症反应，但其发病机制尚不明确[3]。内质网应激反应(Endoplasmic Reticul Stress，ERS)参与多种炎症和过敏性疾病发生、发展过程，影响蛋白质正确折叠，促进肺部炎症，导致肺结构和功能异常。研究ERS在哮喘中的作用机制，有助于寻找治疗哮喘的新靶点[3-4]。黏蛋白5AC(Mucin5AC，MUC5AC)是由杯状细胞分泌的一种黏蛋白，是气道黏液的主要成分，在哮喘患者体内异常高表达[5]。ERS及MUC5AC与哮喘关系密切，但MUC5AC初期介导进入内质网的确切机制尚不明确[6]。本研究通过观察哮喘大鼠气道上皮MUC5AC表达，旨在探讨其转移入内质网的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠50只，7周龄，体质量(200±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，购入后适应性饲养7 d。本研究获我院伦理委员会批准，符合动物试验的伦理学要求。

1.2 主要试剂和仪器 卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)、氢氧化铝[Al(OH)3]、4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate，4-PBA)、乙酰甲胆碱(美国Sigma公司)；含Sec61小干扰RNA(Small Interfering RNA，siRNA)及无意义随机对照序列的pGCsilencer U6重组质粒(上海联迈生物工程有限公司)；大鼠白介素-4(Interleukin，IL-4)、干扰素-γ(Interferon-γ，INF-γ)ELISA试剂盒、兔抗大鼠葡萄糖调节蛋白78(Glucose-Regulated Protein 78，GRP78)、C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(C/EBP Homologous Protein，CHOP)、Sec61多抗、山羊抗兔IgG-HRP(美国Abcam公司)；420 AI超声雾化器(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司)；动物气道高反应检测系统(美国Buxco公司)；BC-500全自动血液细胞分析仪(深圳迈瑞医疗电子股份有限公司)。

1.3 建模、分组及干预 随机取50只大鼠建立哮喘模型[7]：分为对照组、OVA组、siRNA组、阴性对照(Negative Control，NC)组及4-PBA组，每组10只。1 g OVA+1 g Al(OH)3溶于PBS中制成致敏液，除对照组外，其他各组分别于双足、双侧腹股沟及腹腔皮下注射致敏液，每点注射200 μL，每周1次，连续2周；第3周开始，于雾化箱内进行雾化激发，将含有1% OVA的PBS溶液以雾化量0.8 mL/min进行雾化，20 min/d，连续4周。对照组以PBS代替致敏和激发。以出现典型哮喘症状、气道炎症和气道高反应性为建模成功标准，后续实验验证了此次模型均建立成功[8]。根据脂质体LipofectamineTM2000说明书，第3周开始，每周第1次激发前，分别将200 μL含有pGCsilencer U6-Sec61shRNA、pGCsilencer U6-Sec61shRNA-NC质粒的质粒脂质体复合物经尾静脉注入siRNA组、NC组大鼠体内，同时灌胃2 mL/kg生理盐水；对照组和OVA组按200 μL/只尾静脉注射PBS，同时灌胃2 mL/kg生理盐水；4-PBA组按2 mL/kg(1 g/kg)腹腔注射4-PBA，同时尾静脉注射200 μL PBS，作为阳性对照，各组均连续干预4周。

1.4 气道高反应性检测[9]分别用3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 mg/mL浓度乙酰甲胆碱雾化激发哮喘，测定大鼠气道高反应性Penh值变化。

1.5 肺泡灌洗液(BALF)指标检测 灌洗肺泡，收取BALF[10]。离心取上清，按照ELISA试剂盒说明书检测上清IL-4、IFN-γ浓度。取BALF沉淀，计数细胞总数，计算中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞数占细胞总数百分比。

1.6 肺部病理组织学变化 取右肺，4%多聚甲醛中固定24 h，酒精脱水、石蜡包埋、HE染色，封片，镜下观察肺组织病理学变化。

1.7 Western blot检测 呼吸道上皮组织冰上研磨，离心取上清，测定蛋白浓度，变性后进行SDS-PAGE凝胶电泳，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，4 ℃摇床孵育一抗过夜，洗膜，室温孵育二抗2 h，洗膜，ECL显影，分析结果。

2 结果

2.1 一般情况 对照组激发前后状态无明显改变；OVA组大鼠烦躁不安、抓耳挠腮、打喷嚏、咳嗽、呼吸急促等，口鼻、四肢轻度发绀，NC组与OVA组相似；siRNA组、4-PBA组较OVA组有所减轻。

2.2 气道Penh值比较 OVA组各Penh值高于对照组(P<0.05)；siRNA组、4-PBA组各Penh值低于OVA组(P<0.05)。各组Penh值随着乙酰甲胆碱浓度升高而升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠不同浓度乙酰甲胆碱激发时Penh值比较

2.3 BALF中细胞分类 OVA组BALF中细胞总数、中性粒细胞百分比、嗜酸性粒细胞数百分比、淋巴细胞百分高于对照组(P<0.05)；siRNA组、4-PBA组BALF中细胞总数、中性粒细胞百分比、嗜酸性粒细胞数百分比、淋巴细胞百分比低于OVA组(P<0.05)，见表2。

表2 BALF细胞相关指标比较

2.4 BALF中IL-4、IFN-γ水平比较 OVA组BALF上清中IL-4高于对照组，IFN-γ低于对照组(P<0.05)；siRNA组、4-PBA组BALF上清中IL-4低于OVA组，IFN-γ高于OVA组(P<0.05)，见表3。

表3 BALF中IL-4、IFN-γ水平比较

2.5 肺部病理学观察 对照组支气管黏膜上皮完整，结构正常；OVA组杯状细胞增生，支气管管壁增厚，有炎性细胞浸润；NC组病理模型与OVA组相似；siRNA组及4-PBA组较OVA组有所改善，仍可见杯状细胞增生，炎性细胞浸润等现象，见图1。

图1 肺组织病理学观察(HE×200)

2.6 相关蛋白表达水平比较 OVA组Sec61、GRP78、Chop、MUC5AC表达高于对照组(P<0.05)；siRNA组、4-PBA组Sec61、GRP78、Chop、MUC5AC表达低于OVA组(P<0.05)，见表4，图2。

表4 相关蛋白水平比较

图2 蛋白印迹

3 讨论

多种因素引起内质网稳态破坏，细胞错误折叠的蛋白质积滞，从而启动一系列信号通路，细胞停止正确合成蛋白质，甚至引起细胞凋亡，导致ERS，采用ERS抑制剂4-PBA干预，可减轻动物气道炎症，缓解哮喘症状[11-13]。正常情况下，MUC5AC通过物理和化学屏障发挥防御保护上皮细胞作用，在病原或炎症等因素刺激下，表达过度增加，后期经硫化和糖基化修饰，引起黏液过度分泌，形成黏液栓，阻塞气道，增加气道高反应性，导致肺功能下降[14-15]。MUC5AC后期修饰机制已有报道[16]，但大量需折叠修饰的MUC5AC雏形肽初始阶段如何介导转移入内质网的确切机制尚不明确。GRP78、Chop被认为是ERS标志性蛋白，在哮喘患者血清中的表达明显高于正常人群[17]。本研究模型组中GRP78、Chop表达升高，表明ERS与哮喘关系密切。哮喘如何引起内质网内错误折叠蛋白增多，ERS与哮喘之间作用机制尚未明确，故本研究旨在探讨ERS对哮喘的作用机制。

核糖体合成的新生肽链由于N端带有正电荷，难以进入疏水的内质网膜，需要蛋白通道进行转运，Sec61三聚体复合物通过形成疏水通道调节错误折叠蛋白质向内质网的转运，使其进行正确折叠，是ERS调控的关键环节，Sec61突变引起蛋白通道转运功能改变，导致ERS[18-20]。本研究成功建立哮喘大鼠模型，OVA组Sec61蛋白表达显著升高，提示哮喘可诱导Sec61表达，通过构建Sec61干扰序列，OVA组Sec61蛋白表达显著下降，表明干扰序列构建成功；干扰Sec61后，大鼠气道高反应性Penh值、BALF中IL-4水平及淋巴细胞、嗜酸性粒细胞数量显著降低，IFN-γ显著升高，肺组织病理变化得到改善，GRP78、Chop蛋白表达显著下降，提示Sec61参与哮喘ERS，通过敲降Sec61，可减轻哮喘炎症反应，改善肺部病变，降低ERS。肝细胞脂肪变中Sec61异常高表达，参与调节肝细胞ERS，抑制Sec61表达可减轻脂肪变程度[21]。未折叠或错误折叠的蛋白质增加，促使Sec61表达增加，以转运蛋白质进入内质网。研究表明，PM2.5诱导支气管上皮细胞中Sec61高表达，参与调节ERS[22]。Sec61在调控ERS中发挥重要作用，本研究敲降Sec61后，可明显减轻哮喘症状，表明Sec61参与调控哮喘ERS，与哮喘发生、发展过程密切相关。

炎症等因素诱导杯状细胞增生及气道黏液分泌增加，MUC5AC是气道黏液栓最主要大分子组成部分，患者体内MUC5AC表达显著升高，黏液分泌过度增加，阻塞气道，引起肺结构和功能改变，MUC5AC阻塞气道是引起致命性哮喘的主要原因[23]。动物实验显示，MUC5AC在哮喘小鼠模型中表达异常升高，与哮喘炎症病理密切相关[24]。抑制人气道上皮细胞MUC5AC分泌可有效减少黏液分泌，减轻炎症反应[25]。本研究敲降Sec61后，MUC5AC蛋白表达显著下降，表明敲降Sec61表达可抑制哮喘过程中MUC5AC高表达，减轻炎症，改善肺部病变及哮喘症状。内质网门控蛋白Sec61介导蛋白转运入内质网，Sec61表达增加，门控通道开放，导致错误折叠或未折叠蛋白质进入内质网，通过敲降Sec61表达，调节ERS，减少MUC5AC转移进入内质网，减少黏液分泌，减轻炎症，改善肺功能及哮喘症状。

4 结论

ERS参与哮喘发生、发展过程，敲降Sec61表达可减轻ERS，降低MUC5AC表达，改善哮喘大鼠症状，本研究结果可为临床治疗哮喘提供新的干预靶点。