lncRNA TUG1靶向miR-326对哮喘患儿气道平滑肌细胞凋亡和炎症因子的影响

李青华 宋靖荣 董焱 吕白于 吕伟

(上海交通大学医学院附属第九人民医院儿科，上海 201900)

哮喘是小儿常见的慢性呼吸系统疾病，近年来发病率呈上升趋势。哮喘病情易反复发作，难以治愈，给患者后期生活、学习带来极大影响[1-2]。哮喘主要病理特征是持续的气道炎症，气道高反应性和气道重塑等，气道平滑肌细胞参与气道炎症反应，且平滑肌细胞的增殖是哮喘气道重塑的特征性改变，其在哮喘的发生、发展过程中具有重要作用[3-5]。故促进气道平滑肌细胞的凋亡及减轻其引起的炎症反应对哮喘的治疗具有重要意义。研究表明，lncRNA可以调控哮喘气道炎症和气道重塑，有希望成为诊断和治疗哮喘的新型靶点[6]。长非编码RNA牛磺酸上调基因1(lncRNA TUG1)在哮喘大鼠模型中表达水平升高；lncRNA TUG1促进了气道平滑肌细胞(ASMC)的增殖和迁移，并减少了细胞凋亡[7]。抑制lncRNA TUG1可通过miR-34c/BRD4轴减轻香烟烟雾提取物在慢性阻塞性肺疾病中引起的炎症损伤[8]。lncRNA TUG1高表达通过调节miR-21 / PTEN轴促进血管平滑肌细胞的增殖和动脉粥样硬化[9]。干扰lncRNA TUG1可缓解脂多糖诱导的炎症反应[10-11]。然而lncRNA TUG1对ASMC中炎症因子的影响及其机制尚不清楚。miR-326可抑制TGF-β1处理的ASMC的基质蛋白沉积和细胞增殖[12]。抑制circHIPK3可通过miR-326 / STIM1轴抑制ASMC的增殖，迁移并上调细胞凋亡[13]。miR-326在体内可减轻CCl4诱导的小鼠的肝纤维化和炎症[14]。本实验通过在线软件预测显示，lncRNA TUG1与miR-326有互补的核苷酸结合位点。因此，本实验旨在探讨lncRNA TUG1是否通过调控miR-326影响ASMC的凋亡和炎症反应。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2017年1月～2020年6月我院收治的支气管哮喘患儿和非哮喘患儿各9例，年龄5～15岁，平均8岁；从接受了肺切除术的患儿中获得气管段，分离出气道平滑肌束；以非哮喘患儿组织为对照组，所有患儿及家属均知情同意。

1.2 细胞与主要试剂 DMEM培养基(货号：120026，北京凯瑞基生物科技有限公司)；Trizol试剂(货号：5301100，杭州新景生物试剂开发有限公司)；荧光定量试剂盒(货号：QPG-052，上海吉玛制药技术有限公司)；凋亡检测试剂盒(货号：QN1317-CAT，北京百奥莱博科技有限公司)；RIPA蛋白裂解液(货号：QCB-3201-1，上海钦诚生物科技有限公司)；IL-4、IL-5、IL-13酶联免疫吸附试剂盒(货号：E-EL-H0101c、E-EL-H0191c、E-EL-H0104c，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：GM-040502A，上海泽叶生物科技有限公司)。

1.3 气道平滑肌细胞(ASMCs)分离培养 无菌条件下将支气管哮喘患儿的气道平滑肌束，剪成1 mm3的组织块，均匀铺在培养瓶的底部，加入含血清的DMEM培养基，培养4～5 d后可见从组织块边缘爬出少量细胞，随后开始贴壁生长，待细胞长满瓶底80%左右时，倒置显微镜下观察细胞，细胞呈长梭形，成峰谷生长状；然后用0.25%的胰蛋白酶消化传代，取稳定传代4～6代的细胞用于实验。

1.4 细胞转染与分组 取对数生长期ASMCs，将TUG1干扰载体及其阴性对照质粒、miR-326模拟物及其阴性对照转染至ASMCs中，记为si-NC组、si-TUG1组、miR-mimics-NC组、miR-326-mimics组；将TUG1干扰载体阴性对照质粒与miR-326抑制剂阴性对照质粒共转染，TUG1干扰载体分别与miR-326抑制剂及其阴性对照分别共转染至ASMCs中，分别记为si-NC+miR-inhibitor-NC组、si-TUG1+miR-inhibitor-NC组及si-TUG1+miR-326 inhibitor组。

1.5 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测TUG1和miR-326表达水平 提取气道平滑肌组织及细胞的总RNA，反转录成cDNA后按照荧光定量试剂盒说明进行PCR，其中TUG1和miR-326分别以GAPDH和U6为内参，PCR反应体系：2 μL反转录产物、10 μL SYBR Green Mix、上下游引物各0.5 μL，7 μL无菌水；循环条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；融解曲线：95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。最后相对表达量用2-△△Ct法计算。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡 细胞培养48 h，用预冷的PBS漂洗，用结合缓冲液重悬，加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混匀避光孵育10 min；用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 蛋白质印迹(Western blot)法检测Bcl-2、Bax蛋白表达 提取各组细胞总蛋白，将蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗(1∶800)4℃孵育过夜；加入二抗(1∶1000)室温孵育2 h；显影、定影、成像，用Quantity One凝胶分析软件检测蛋白条带的灰度值，以β-actin为内参计算蛋白相对表达水平。

1.8 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-4、IL-5、IL-13水平 各组细胞培养48 h后取上清，具体按照试剂盒操作进行检测。

1.9 双荧光素酶报告实验 构建TUG1野生型和突变型荧光素酶报告载体WT-TUG1和MUT-TUG1，将其分别与miR-NC和miR-326共转染至ASMCs中；按照说明书检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1 TUG1和miR-326在气道平滑肌组织的表达水平 与非哮喘患儿比较，哮喘患儿的气道平滑肌组织中TUG1表达水平升高，miR-326表达水平降低(P<0.05)，见表1。

表1 TUG1和miR-326在气道平滑肌组织的表达水平

2.2 利用RNA干扰技术沉默TUG1后对气道平滑肌细胞的凋亡及炎症因子的影响 与si-NC组比较，si-TUG1组TUG1表达水平降低，细胞凋亡率升高，Bcl-2表达水平降低，Bax表达水平升高，IL-4、IL-5、IL-13水平降低(均P<0.05)，见表2，图1。

表2 沉默TUG1对气道平滑肌细胞的凋亡及炎症因子的影响

图1 沉默TUG1对气道平滑肌细胞的凋亡及炎症因子的影响

2.3 双荧光素酶实验 TUG1的核酸序列中存在与miR-326互补的序列，见图2。WT-TUG1与miR-326共转染后的细胞荧光素酶活性降低，MUT-TUG1与miR-326共转染后的细胞荧光素酶活性无显著变化，

图2 TUG1的核酸序列中存在与miR-326互补的序列

见表3。与si-NC组比较，si-TUG1组TUG1表达水平降低，miR-326表达水平升高(P<0.05)，见表4。

表3 TUG1和miR-326的双荧光素酶实验

表4 TUG1靶向负相关

2.4 过表达miR-326对气道平滑肌细胞的凋亡及炎症因子的影响 与miR-mimics-NC组比较，miR-326-mimics组miR-326表达水平升高，细胞凋亡率升高，Bcl-2表达水平降低，Bax表达水平升高，IL-4、IL-5、IL-13水平降低(P<0.05)，见表5，图3。

表5 过表达miR-326对气道平滑肌细胞的凋亡及炎症因子的影响

图3 过表达miR-326对气道平滑肌细胞的凋亡及炎症因子的影响

2.5 干扰miR-326能逆转沉默TUG1对气道平滑肌细胞的凋亡及炎症因子的影响 与si-NC+miR-inhibitor-NC组比较，si-TUG1+miR-inhibitor-NC组miR-326表达水平升高，细胞凋亡率升高，Bcl-2表达水平降低，Bax表达水平升高，IL-4、IL-5、IL-13水平降低(均P<0.05)；与si-TUG1+miR-inhibitor-NC组比较，si-TUG1+miR-326 inhibitor组miR-326表达水平降低，细胞凋亡率降低，Bcl-2表达水平升高，Bax表达水平降低，IL-4、IL-5、IL-13水平升高(均P<0.05)，见表6，图4。

图4 干扰miR-326能逆转沉默TUG1对气道平滑肌细胞的凋亡及炎症因子的影响

表6 干扰miR-326能逆转沉默TUG1对气道平滑肌细胞的凋亡及炎症因子的影响

3 讨论

支气管哮喘是儿童时期最常见的疾病之一，研究发现一些lncRNA与炎症反应以及气道平滑肌细胞有着密切的联系，推断lncRNA可能参与调控哮喘的发生、发展[15-16]。已有研究报道lncRNA TUG1影响ASMC的增殖、迁移和凋亡[7]，且lncRNA TUG1还可促进高血压状态下血管平滑肌细胞的增殖和迁移[17]。沉默lncRNA TUG1抑制了ox-LDL处理的血管平滑肌细胞的增殖并促进细胞凋亡[18]。此外，lncRNA TUG1还参与炎症反应过程，如抑制lncRNA TUG1可抑制TLR4信号通路介导的大鼠脊髓缺血再灌注的炎症损伤[19]。lncRNA TUG1的下调通过使miR-449b-5p海绵化，从而减轻了缺血再灌注诱导的肾小管上皮细胞的炎症[20]。TUG1通过靶向结合miR-29b-1-5p调节MTDH/NF-κB/IL-1β通路减轻脊髓缺血再灌注损伤炎症损伤[21]。本实验检测了哮喘患儿气道平滑肌组织中TUG1的表达水平，结果显示TUG1高表达，与以往研究结果相符[7]。进一步沉默lncRNA TUG1的表达，结果显示，ASMCs中细胞凋亡率升高，Bcl-2表达水平降低，Bax表达水平升高，IL-4、IL-5、IL-13水平降低。IL-4、IL-5、IL-13均是炎症反应启动和传递的必要的因子，通过增加气道炎症可加重哮喘[22]。因此，本实验结果表明沉默lncRNA TUG1不仅可以促进ASMC凋亡，还可抑制炎症反应。

已有研究报道，miR-326影响ASMC的增殖[12]。本实验结果显示，哮喘患儿气道平滑肌组织中miR-326表达水平降低；而过表达miR-326后，ASMCs中细胞凋亡率升高，Bcl-2表达水平降低，Bax表达水平升高，说明过表达miR-326可促进ASMCs凋亡。此外，miR-326还参与细胞炎症反应有关；如miR-326通过分别靶向TNFSF14和PTBP1来减轻二氧化硅诱导的肺纤维化，从而抑制炎症并促进自噬活性[23]。miR-326通过下调TLR4抑制巨噬细胞中脂多糖诱导的炎症和氧化应激[24]。本实验结果显示，过表达miR-326后ASMC中IL-4、IL-5、IL-13水平降低；表明过表达miR-326抑制了ASMC的炎症反应。

为研究lncRNA TUG1与miR-326的关系，本实验首先通过在线软件预测，发现lncRNA TUG1的核酸序列中存在与miR-326互补的序列，说明TUG1可结合miR-326；本研究进一步构建了含miR-326结合位点的TUG1野生型和突变型荧光素酶报告载体，将其分别与miR-NC和miR-326共转染至ASMCs中检测细胞荧光素酶活性，结果显示WT-TUG1与miR-326共转染后的细胞荧光素酶活性降低，MUT-TUG1与miR-326共转染后的细胞荧光素酶活性无显著变化；且抑制TUG1表达后miR-326表达水平升高；表明TUG1可靶向负调控miR-326的表达。为研究miR-326对TUG1的影响，本实验在干扰miR-326的同时沉默TUG1，结果显示，ASMC的凋亡率降低，Bcl-2表达水平升高，Bax表达水平降低，IL-4、IL-5、IL-13水平升高；表明而干扰miR-326逆转了沉默TUG1对气道平滑肌细胞凋亡及炎症因子的影响。这表明TUG1可与miR-326相互作用影响气道平滑肌细胞凋亡及炎症。

4 结论与启示

沉默lncRNA TUG1可通过靶向调控miR-326促进哮喘患儿气道平滑肌细胞凋亡，抑制炎症因子的释放。本实验目前仅在体外进行细胞实验，还有待于进一步进行体内实验予以证实。