野黄芩素在结肠癌发生发展中的作用机制研究

李远志 王钧冬 岳朝驰 龙 庆 李 俊

1.西南医科大学临床医学院 西南医科大学附属医院中医科，四川泸州 646000；2.成都中医药大学附属医院脾胃病科，四川成都 610000

结肠癌是全球第三大常见的恶性肿瘤和第四大癌症死亡原因[1]。目前结肠癌的主要治疗方式是手术辅以放疗或化疗，然而患者的5年生存率仅为65.2%[2]，表明目前的治疗方法无法根除癌细胞。因此，急需寻找新的治疗结肠癌的有效方法。中药半枝莲的主要活性成分野黄芩苷，是一种主要由肽多糖等构成的黄酮类化合物，具有抗肿瘤的作用[3-4]。野黄芩素作为野黄芩苷的苷元，更易吸收，生物活性更高，生物利用度更好[5]，但其抗结肠癌作用及相关机制报道较少。因此，本研究拟探索野黄芩素在结肠癌发生、发展中的作用及其相关机制，为野黄芩素在临床治疗结肠癌提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系及实验动物 人结肠癌细胞系T84 购买于上海北诺生物科技有限公司；15 只雄性无胸腺BALB/C 裸鼠，SPF 级，5～6 周龄，体重18～20 g，购买于成都达硕实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（川）2020-030。裸鼠饲养于屏障系统中，12 h 明暗周期自动交替，采取自由采食，自由饮水的方式喂养。本实验已报备医院动物伦理委员会批准通过。

1.1.2 主要试剂及耗材 本研究所需要的试剂及耗材购买均来源于北京傲锐东源生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 药品制备 将野黄芩素溶于二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，制成100 mM 的母液备用。

1.2.2 细胞培养 T84 细胞培养于含5%胎牛血清、2.5 mM 谷氨酰胺的DMEM/F12 培养基中，培养箱环境设置为温度37℃，CO2浓度5%，间隔一天更换细胞液直至细胞融合度达到80%～90%后进行细胞传代。

1.2.3 细胞转染 在转染之前的24 h，按照密度为5×105/mL 的标准在24 孔培养瓶中进行细胞接种，采用脂质体lipofectamine 2000 将对照载体和表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）过表达质粒转染到T84 细胞里，随后对细胞的转染效率则进行检测。

1.2.4 Western Blot 检测蛋白表达 将细胞加入100 μL 计量的RIPA 裂解液，裂解、变性，同时经BCA定量，随后取蛋白20 μg 进行电泳分离，后转到硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶封闭液中进行时长1 h 的常温封闭，4℃环境下一抗过夜孵育，清洗，之后对二抗（辣根过氧化物酶标记）进行时长1 h 的室温孵育，同时化学荧光显色。内对照为GAPDH。

1.2.5 实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）采用Trizol 试剂提取细胞中的总RNA，后将其逆转成cDNA 后按照试剂盒相关说明进行RT-PCR，后采用2-Ct 方法对mRNA 的含量进行定量，实验中所用的引物序列如下。EGFR-正向引物：5′-CCCTCCTGAGCTCTCTGAGT-3′，EGFR-反向引物：5′-GTTTCCCCCTCTGGAGATGC-3′；GAPDH-正向引物：5′-CTCCTGTTCGACAGTCAGCCG-3′，GAPDH-反向引物：5′-CCTAGCCTCCCGGGTTTCTC-3′。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 胰酶消化细胞后，收集细胞使每组细胞不少于3×105个细胞，每组细胞设置3 个复孔，冰浴PBS 清洗2 遍，1000 r/min 离心5 min，留取细胞沉淀，每组加入1×Annexin V Binding Buffer 100 μL，充分混匀细胞，将5 μL FITC Annexin V 染液，5 μL PI 染液加入到每组细胞中，避光室温反应，时长15 min，然后每管加300 μL 1×Annexin V Binding Buffer 溶液，1 h 流式细胞仪检测[6]。

1.2.7 MTT 法检测细胞增殖 调整T84 细胞密度为1×104个/mL，将悬浮液均匀后的200 μL 细胞在96孔培养板中进行接种，等到细胞贴壁之后，加入浓度分别为10、20、40、80、160 μmol/L 的野黄芩素，同时设置空白对照组，5 个复孔/组。在分别24、48、72 h 培养时长后，对培养基（200 μL 计量）进行更新，同时加入浓度为5 g/L 的MTT 溶液20 μL 孵育4 h，舍弃上清，加入DMSO 200 μL 后震荡10 min，测定吸光度A（波长处为570 nm），对半数抑制浓度（IC50）进行计算。细胞增殖抑制率=（1-A药物组/A空白组）×100%。

1.2.8 划痕实验检测细胞迁移能力 用不含血清的DMEM/F12 培养基制成1×106个/mL 细胞悬液，加入6 孔板，每孔1 mL，培养过夜，待细胞融合度达到100%时用无菌20 μL 的白枪头垂直划出3 道直线，后加药物处理，观察细胞的愈合情况。划痕后0 h 和24 h拍照。

1.2.9 Transwell 小室检测细胞侵袭能力 ①包被基底膜：先按Matrigel 胶1 倍，培养基3 倍配制Matrigel胶稀释液，后取40 μL Matrigel 胶稀释液将Transwell小室底部膜的上室包被，4℃环境下风干[7]。②接种细胞：将T84 细胞用不含血清培养基进行重悬，将细胞密度调整到2×105/mL，于Transwell 小室上室中加入200 μL 细胞悬液，同时取600 μL 含20% FBS 的完全培养基加入到24 孔板下室，之后置于细胞培养箱中进行时长48 h 的细胞培养[8]。③结果判断：48 h 后将Transwell 膜弃去上清，PBS 冲洗3 次；冷的无水甲醇固定10 min，空气干燥，结晶紫染色5 min；用棉签将上层未迁移细胞擦去，PBS 冲洗3 次[9]；显微镜下观察，拍照，200 倍镜下计算平均数。

1.2.10 免疫共聚焦 将2×104个细胞制成细胞悬液，均匀接种在放置载玻片的24 孔板中，第2 天加野黄芩素（30 μmol/L）处理细胞，48 h 后，用多聚甲醛（4%）进行10 min 固定，Triton X-100 孵育10 min 后将细胞膜穿透；用20%的山羊血清（PBST 配制），室温封闭1 h；玻片放在湿盒中，滴加一抗工作液（ERK1/2）4℃孵育过夜，后滴加二抗工作液室温孵育1 h，DAPI 孵育5 min，抗衰减荧光封片剂封片后在共聚焦显微镜（200 倍镜）下采图。

1.2.11 荷瘤实验 本研究在结肠癌细胞T84 中过表达了EGFR，并将15 只BALB/C 裸鼠随机分为对照组、野黄芩素组及野黄芩素+EGFR 过表达组，每组5 只裸鼠。取1×107处于对数生长期的T84 细胞及EFGR 稳定过表达的T24 细胞，重悬于200 μL PBS，于BALB/C 裸鼠双侧腋下接种，待肿瘤大小为1 cm3左右且肉眼可见时，将野黄芩素组及野黄芩素+EGFR过表达组小鼠给予野黄芩素[20 mg/（kg·周）]灌胃，共2 次，对照组不作处理。后于细胞接种28 d 后杀死各组小鼠取肿瘤，检测肿瘤的大小和质量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析，每组实验至少重复三次，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间的比较采用One-Way ANOVA 检测，两组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 野黄芩素对结肠癌细胞增殖凋亡的影响

MTT 实验结果显示，随着野黄芩素作用时间的延长及药物浓度的增加，细胞增殖抑制率越来越高，且野黄芩素作用24、48 及72 h 的IC50值分别为78.5、36.7、和25.6 μmol/L（图1A）。基于此研究，在接下来的实验中笔者将野黄芩素组的使用浓度定为30 μmol/L，与空白对照组进行比较，两组的作用时间定为48 h。通过Western Blot 实验发现野黄芩素组较空白对照组的Bax、caspase3 及caspase9 的表达上调，而Bcl-2 的表达下调（P＜0.05）（图1B）。流式细胞术结果显示，同对照组相比，野黄芩素处理后细胞的凋亡比例上升（P＜0.05）（图1C）。

2.2 野黄芩素对结肠癌细胞转移侵袭的影响

通过划痕实验及Transwell 小室实验检测发现，与对照组比较，野黄芩素组可明显降低结肠癌T84 细胞的转移和侵袭能力（P＜0.05）（图2）。

图2 野黄芩素对结肠癌T84 细胞转移侵袭的影响

2.3 野黄芩素对EGFR/ERK1/2 通路的影响

同对照组相比，野黄芩素组EGFR 和p-ERK1/2的蛋白水平均降低（P＜0.01）（图3A），并促进ERK1/2出核（图3B），同时降低ERK1/2 通路下游转录因子c-myc、c-fos 的表达（P＜0.01）（图3C）。

图3 野黄芩素对T84 细胞中EGFR/ERK1/2 通路的影响

2.4 野黄芩素对结肠癌发生发展的影响及与EGFR/ERK/1/2 通路的相关性研究

转染EGFR 的过表达质粒明显促进了EGFR 的表达（P＜0.05）（图4A）。与野黄芩素组相比，野黄芩素+EGFR 过表达组细胞的增殖能力升高（P＜0.05）（图4B），且体外成瘤能力明显增强（P＜0.01）（图4C），凋亡水平降低（P＜0.05）（图4D）。

图4 野黄芩素对结肠癌发生发展的影响及与EGFR/ERK/1/2 通路的相关性

3 讨论

野黄芩苷是半枝莲的主要活性成分，可通过抑制血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达以及促进内皮型-氧化氮合酶（endothelial-nitric oxide synthase，eNOS）表达来改善脑血管功能[10-11]；此外，其可通过降低Bcl-2/Bax 的比值[12]，提高天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate-specific protease，caspase）的表达[13]，激活Fas及FasL 死亡受体蛋白的表达[14]促进肿瘤细胞凋亡达到抗肿瘤作用。野黄芩素是野黄芩苷的苷元和其体内吸收的主要水合形式，其生物利用度为野黄芩苷的3 倍[15]。近年来，Cheng 等[16]研究发现，野黄芩素可抑制肺癌A549 细胞的增殖。本研究结果提示，野黄芩素可明显降低结肠癌T84 细胞的增殖活性，促进其凋亡，并降低结肠癌细胞的转移、侵袭能力，显著抑制了体外肿瘤生成。此外，本研究结果还显示，野黄芩素处理可降低EGFR、p-ERK1/2 的表达，提示野黄芩素可抑制EGFR/ERK1/2 通路的激活。EGFR 是分布于细胞表面的糖蛋白，可促进ERK1/2 蛋白激活，并进入细胞核在c-myc、c-fos 等转录因子中发挥作用，进而达到提高某些癌基因的高表达与异常转录的效果[17]。多项研究表明，EGFR 在多种肿瘤组织或细胞中被过度激活并通过激活其下游ERK1/2 信号通路参与肿瘤的发生发展进程[18-19]。Zhang 等[20]发现下调HOXA3 表达介导的EGFR/ERK 通路抑制可明显抑制结肠癌细胞的成瘤能力。同时，本研究还发现野黄芩素可促进ERK1/2 蛋白出核，并抑制其下游转录因子c-myc、c-fos 的表达，进一步表明野黄芩素可抑制EGFR/ERK1/2 通路的激活。此外，为了探究EGFR/ERK1/2 通路参与调控野黄芩素的抑癌机制，本研究在EGFR 过表达的基础上给予细胞野黄芩素处理，发现细胞的增殖能力增强，凋亡受到抑制。小鼠荷瘤实验同样也证明野黄芩素的抑癌作用在EGFR 过表达后受到显著抑制。

综上所述，野黄芩素可通过抑制EGFR/ERK1/2通路的激活抑制结肠癌的发生发展，为野黄芩素应用于结肠癌患者的临床治疗提供了理论依据。