超声波辅助提取黄花菜中类胡萝卜素工艺研究

吴天珍，孙利平，张庆霞，窦宗信，李冠男，高 峰

(甘肃农业职业技术学院,甘肃 兰州 730030)

黄花菜(Hemerocallis Citrina Baroni)又称金针菜，属百合科萱草属，为多年生宿根植物，食用部分为花蕾，是我国的特色蔬菜[1]。甘肃庆阳是久负盛名的黄花菜之乡。2006年12月22日原国家质检总局批准对“庆阳黄花菜”实施地理标志产品保护。2019年庆阳黄花菜面积达到4.67万hm2以上，黄花菜产业也逐步成为当地群众脱贫奔小康的“金色产业”。黄花菜集营养、药疗、观赏于一体，尤其是其营养价值远远高于其他蔬菜[2]。黄花菜蛋白量高、热值低、富含维生素及矿物质。发现的主要化学成分有生物碱、黄酮类、维生素、类胡萝卜素、挥发油、靴质以及无机矿物如钙、磷、钠、钾、锰、铭、钡和铝等，其所含的类胡萝卜深度比拘祀子大三倍，甚至超过西红柿的几倍[3]。类胡萝卜素是一类天然化合物的总称, 大量存在于植物中，还存在于许多微生物(如光合细菌)和动物体内，是生物体必不可少的成分。类胡萝卜素呈黄色、红色或橙红色, 具有食品着色剂和营养增补剂的双重功效, 因而被广泛应用于食品、化妆品和饲料添加剂中[4]。近年来的医学研究证明, 类胡萝卜素具增强免疫力、抗氧化和延缓衰老、预防肿瘤和心脑血管疾病、抗癌症等功能[5]。因此, 类胡萝卜素在国内外食品、医药工业中一直处于供不应求的状态。目前，类胡萝卜素的提取方法主要包括：有机溶剂提取法、层析法、超临界CO2萃取法和超声波法等[6]。超声波能产生并传递强大的能量，促进细胞内有效成分的溶出，具有操作简便、能耗低、效率高、不破坏有效成分等特点[7]。因此，笔者试验利用单因素试验和正交试验对超声波法提取黄花菜中类胡萝卜素的工艺进行了优研究，以期为黄花菜中类胡萝卜素的提取提供技术参考。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

试验样品：2020年7月下旬在甘肃省庆阳市西峰区后官寨采集黄花菜花蕾。

试验试剂：甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚、正己烷和BHT抗氧化剂, 均为分析纯。

实验仪器：PL203型电子天平；TGL-20M湘仪离心机 ；TU-1900双束紫外可见光分光光度计北京普析通用仪器； KH3200B型超声波清洗仪 ；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-91013SA型)

1.2 方法

1.2.1 黄花菜中类胡萝卜素提取工艺过程 黄花菜鲜样→蒸馏水浸泡30 min左右(除去糖分及秋水仙碱)→烘箱烘干(50℃)→粉碎(60目)→称取黄花菜粉末0.25 g→加入含有0.1%BHT的有机溶剂25 mL→超声波辅助提取→离心取上清液→定容至50 mL→测定吸光度值→计算类胡萝卜素含量。

1.2.2 黄花菜中类胡萝卜素测定条件选择 利用UV-型紫外可见光分光光度计，以提取溶剂为空白对照在波长350～600 nm下扫描，确定所提黄花菜类胡萝卜素的最佳吸收波长。采用不同的有机提取溶剂及配比：甲醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、氯仿、丙酮石油醚(1∶1)、丙酮乙醇(1∶1)，按1.2.1提取工艺确定最佳提取溶剂。

1.2.3 黄花菜中类胡萝卜素含量计算 黄花菜中类胡萝卜素的总含量以Y记，单位 (mg·100g-1)，按以下公式进行计算[8]：

式中：A-在445nm波长下提取液样品的吸光值；V-类胡萝卜素提取液样品体积(mL)；N-提取液样品稀释的倍数；2500-1%类胡萝卜素在最大吸收波长是的平均吸光值；m-类胡萝卜素提取液样品的质量(g)。

1.2.4 单因素试验 通过单因素试验分别考察料液比、超声时间、超声温度和超声功率对提取黄花菜类胡萝卜素含量的影响。

(1)料液比对提取黄花菜类胡萝卜素含量的影响。称取黄花菜粉末0.25 g，按料液比(g:mL)分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25加入含0.1%BHT的丙酮乙醇(1∶1)提取溶剂。设置超声时20 min、超声温度45℃、超声功率200 W,筛选提取类胡萝卜时最佳的料液比。

(2)超声温度对提取黄花菜类胡萝卜素含量的影响。称取黄花菜粉末0.25 g，加入含有0.01%BHT的丙酮石乙醇(1∶1)有机提取溶剂10 mL。设置超声时间20 min、超声功率200 W，考察超声温度25、35、45、55、65℃对提取类胡萝卜素含量的影响。

(3)超声时间对提取黄花菜类胡萝卜素含量的影响。称取黄花菜粉末0.25 g，加入含有0.01%BHT的丙酮乙醇(1∶1)有机提取溶剂10 mL。超声温度设置为45℃、超声功率200 W，分析超声时间10、20、30、40、50 min对提取类胡萝卜素含量的影响。

(4)超声功率对提取黄花菜类胡萝卜素含量的影响。称取黄花菜粉末0.25 g，加入含有0.01%BHT的丙酮石油醚(1∶1)有机提取溶剂10ml。超声温度设置为45℃、超声时间20 min，分析超声功率100、150、200、250、300 W对类胡萝卜素提取含量的影响。

1.2.5 正交试验 以单因素试验为基础，对料液比、超声温度、超声时间和超声功率进行L9(34)正交试验，优化黄花菜中类胡萝卜素提取工艺。正交试验因素及水平见表1。

表1 正交试验中的因素与水平

2 结果与分析

2.1 类胡萝卜素提取条件的筛选

2.1.1 最佳吸收波长确定 用分光光度测定类胡萝卜素含量时，在定量测定前，应使用紫外-可见光分光光度计对样品进行最佳吸收波长的扫描测定，以便后续测定的准确性[9]。在350～600 nm条件下对黄花菜类胡萝卜素提取溶液进行波长扫描，不同有机提取液的吸收光谱均具有类胡萝卜素的特征吸收值。由图1可以看出，以丙酮、石油醚、丙酮石油醚(1∶1)丙酮乙醇(1∶1)的类胡萝卜素提取液吸收峰基本一致，均集中在440～480 nm波长下，其中445 nm下波长较为突出，因此选择提取液类胡萝卜素含量测定的波长为445 nm。

图1 类胡萝卜素提取溶剂在350～600nm下波长光谱

2.1.2 最佳提取溶剂的确定 不同种类的提取溶剂及提取溶剂间的组合，影响类胡萝卜素的提取效率。由图2可知，在提取效果上以丙酮石油醚(1∶1)最好，显著高于其它提取溶剂；其次为丙酮乙醇(1∶1)和丙酮，在类胡萝卜素的提取效果上上无显著差异；再次为甲醇优于乙酸乙酯优于石油醚；正己烷提取效果较差。由于丙酮石油醚(1∶1)所提取类胡萝卜素含量最多，因此确定为黄花菜类胡萝卜素提取溶剂。

图2 不同有机溶剂对类胡萝卜素提取含量的影响

2.2 单因素试验

2.2.1 料液比 从图3可以看出，在低料液比时，所测得类胡萝卜素含量随料液比的增加而提高。当料液比超过(1∶20 g·mL-1)时类胡萝卜素的含量增加趋于平稳，即此时材料中的类胡萝卜素基本被提取出，此后在继续增加料液比，所测类胡萝卜素含量变化基本不明显。在考虑高效，低成本的因素下，选取1∶20为最佳料液比。

图3 不同料液比下类胡萝卜素提取含量

2.2.2 超声温度 由图4可知，超声温度低于35℃时，提取的类胡萝卜素含量随温度的升高增加明显，超声温度高于55℃之后，随温度的升高所测类胡萝卜素的含量反而降低。可能是超声温度过高导致类胡萝卜素发生降解，因此选55℃为超声提取温度。

图4 不同超声温度下类胡萝卜素提取含量

2.2.3 超声时间 由图5可知，所提类胡萝卜素的含量随超声时间的延长呈现升高后下降的趋势，超声20min时类胡萝卜素的含量为最大，此后随超声时间的延长所提类胡萝卜素的含量呈下降趋势, 超声时间过长可能导致类胡萝卜素的降解速率大于溶出速率，或者有杂质溶出,因此选择超声时间为20 min。

图5 不同超声时间下类胡萝卜素提取含量

2.2.4 超声功率 由图6可以看出，超声功率在100～250 W时，随超声功率的增加类胡萝卜素的含量增加逐渐增加。在250 W时所提类胡萝卜素的含量最高，之后增大超声功率，反而类胡萝卜素的含量略有下降。可能超声功率过大时破坏类胡萝卜素其成份的有效结构，因此选择250 W为提取最佳功率。

图6 不同超声波功率下类胡萝卜素提取含量

2.3 黄花菜类胡萝卜素的超声提取工艺的正交优化

表2为正交试验结果，通过极差分析可知，RB>RA>RC>RD,对类胡萝卜素含量的提取因素影响大小，依次为超声温度>料液比>超声时间>超声功率。在类胡萝卜素提取时超声温度的影响最显著，其中K2最大，表明水平B2效果好；其次是料液比，其K2值最大，表明水平A2效果好；然后是超声时间以水平C2效果好；最后是超声功率以水平D2效果好。由于超声功率对类胡萝卜素含量的提取影响不显著，因此不用选择其K值最大的水平。综上所述最优的提取方案为A2B2C2D1，即制备黄花菜粉末中类胡萝卜的最佳工艺条件为料液1∶20 g·mL-1、超声温度55℃、超声时间20 min、超声功率200 W。准确称取3份样品，在最佳工艺条件下进行3组平行试验，测得其类胡萝卜素提含量分别为62.25、62.19、62.03 mg·100g-1。由此可见，该方法试验的重现性较好，稳定可行。

表2 类胡萝卜素提取工艺的正交试验结果

3 讨论结论

(1)目前，对不同种类和组合的有机溶剂提取类胡萝卜素的研究结果存在差异。鉴于研究材料和方法的不同，研究者所选用的提取溶剂也不尽相同。朱建飞等[10]用丙酮甲醇(2∶1)为提取溶剂提取紫苏粕中的类胡萝卜素；郭鹏飞[11]以95%乙醇作为提取溶剂，对番木瓜果肉进行类胡萝卜素的提取；莫玉楠等[12]以丙酮乙醇(1∶1)为提取溶剂提取橙色大白菜中的类胡萝卜素；孙明奇[13]以丙酮石油醚(2∶1)为提取溶剂，采用超声波法提取柑橘果皮中的类胡萝卜素；王晓璇等[14]选用乙酸乙酯和乙醇(1∶1)为提取溶剂，提取枸杞皮渣中类胡萝卜素。笔者试验通过选用丙酮、石油醚、甲醇等常用有机试剂的比较，认为黄花菜类胡萝卜素的最佳提取溶剂为丙酮石油醚(1∶1)。

(2)紫外可见光所显示的最高峰的位置、吸收光谱的形状为类胡萝卜素的结构解析提供了重要信息[9]。笔者试验中不同提取溶剂下黄花菜中类胡卜素的紫外-可见光光谱吸收峰值多在在445 nm、450 nm、475和480 nm处,具有类胡萝卜素的特征吸收值，而且与文献中[15,16]叶黄素的吸收峰特征值相一致，说明黄花菜类胡萝卜素组分中叶黄素的含量很高。但关于黄花菜中类胡萝卜素的主要成分测定和分离纯化还有待于进一步研究。

(3)笔者试验以黄花菜为材料，利用单因素和正交试验，优化其类胡萝卜素的超声波法提取条件，结果为用丙酮石油醚(1∶1)为提取试剂，按料液比1∶20(g·mL1-)，超声温度55℃，超声时间25 min，超声功率200 W进行超声提取后在445 nm下测定类胡萝卜素提取液的吸光光度值。在此条件下测得类胡萝卜素含量为62.4 g·100 g-1，且重复性好。因此，超声辅助工艺适用于黄花菜中类胡萝卜素的提取，且效率高、方便快捷、绿色环保，同时也说明黄花菜是较好的类胡萝卜素源植物。