超高效液相色谱-串联质谱法测定不同pH值溶液中三叶苷平衡溶解度和表观油水分配系数*

张远冬，高健美，龚其海

(遵义医科大学1.药学院；2.基础药理省部共建教育部重点实验室，遵义 563000)

三叶苷是从多穗柯中分离出的一种二氢查尔酮化合物，其结构为根皮素-4’-β-D-葡萄糖苷。在甜茶嫩叶中，三叶苷含量为82.9 ～ 103.1 mg·g-1，是含量最高的活性成分[1]。药理学研究表明，三叶苷能明显抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性，进而有效降低大鼠的血糖水平[2]；同时，三叶苷下调肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6表达水平，并抑制其分泌，具有减轻内毒素诱导的炎症反应的作用[3]。研究发现，三叶苷能够清除细胞内和线粒体内过多的氧自由基，提高抗氧化物酶活力，对过氧化氢(H2O2)诱导的PC12细胞氧化应激损伤具有保护作用[4]；进一步的体内研究显示，三叶苷灌胃给予局灶性脑缺血-再灌注损伤模型大鼠后，可显著抑制大鼠大脑中动脉栓塞后神经炎症和氧化应激损伤，从而有效改善大鼠大脑急性缺血造成的神经功能缺陷，并减小脑缺血梗死体积[5]。这些研究表明，三叶苷具有较好的潜力开发应用于炎症、缺血性脑卒中等疾病的治疗。

然而，三叶苷水溶性极低，在实验中存在给药困难以及给药剂量不准确的问题；在体内研究中，常常需要口服给予大剂量的药物才能发挥治疗作用[5]。这些因素极大限制了三叶苷的研究及应用。因此，探明三叶苷的基本理化性质，并研发合适的药物新制剂，提高三叶苷溶解度极为重要。目前，关于三叶苷的文献报道多集中于提取工艺及药理学研究，而对三叶苷理化性质研究鲜有报道。笔者通过建立超高效液相色谱-串联质谱(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS/MS)方法准确测定三叶苷的含量，并结合饱和溶液法和摇瓶法测定三叶苷在不同pH值溶液中的平衡溶解度及油水分配系数[6-7]，初步考察其溶解性和渗透性，为后续三叶苷体内生物利用度、药动学研究以及药物新制剂的设计和制备提供参考。

1 仪器与试剂

1.1仪器 Triple TOF 4600高分辨质谱系统(美国ABSCIEX公司)；LC-30AD超高效液相系统(日本Shimadzu公司)；电子天平(德国Sartorius公司，感量：0.01 mg)；Cary 300紫外-可见分光光度计(美国Varian公司)；Mettler Toledo pH值计(瑞士)；UPH-II-10T 优普超纯水仪 (西安优普仪器设备有限公司)；Allegra TM X-22R离心机(美国贝克曼公司)；TCYQ水浴恒温振荡器(江苏太仓实验设备厂)；孔径0.45 μm微孔滤膜(杭州驰骋医药科技有限公司)。

1.2药品与试剂 三叶苷对照品(南京泽郎生物科技有限公司，批号：161009，含量≥98%)；色谱级乙腈(美国Sigma公司)；甲醇、正辛醇、甲酸、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠等均为优级纯(阿拉丁、成都依云化工原料有限公司)。

2 方法与结果

2.1色谱条件 超高效液相检测条件为：系统选用Kinetex XB-C18柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)，流动相为0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B)，采用梯度洗脱程序：起始B为10%并持续1.00 min；1.00～8.00 min B变为80%，并持续至12.00 min；12.01 min B变为10%并持续至15.00 min。流速为300 μL·min-1；柱温为30 ℃。

2.2质谱条件 Triple TOF 4600高分辨质谱系统采用电喷雾电离离子源，分别采用Positive离子化方式；质量扫描范围m/z100～1000；鞘气为379 kPa，辅助气为379 kPa；气帘气为172 kPa，雾化温度600 ℃，采用TOF-MS-Product Ion-IDA扫描模式，TOF/MS一级预扫描和触发的二级扫描Product Ion-IDA离子累积时间分别为250，100 ms，解簇电压80 V，CE碰撞能量为35 eV，CES碰撞能量叠加为(35±15) eV。

2.3溶液的制备

2.3.1三叶苷对照品溶液的配制 精密称取三叶苷对照品10.30 mg于10 mL棕色量瓶，加甲醇完全溶解并定容，配制成浓度为1.03 mg · mL-1的储备液。

2.3.2不同pH值缓冲液的配制 根据《中华人民共和国药典》2015年版8004缓冲液配制方法，分别配制pH值为1.2，2.0，4.5，6.5，7.5，8.0，9.0，10.5，11.0，12.0的磷酸盐缓冲液(PBS)，用精密pH计测定，并校正至所需pH值。

2.3.3正辛醇饱和溶液及水饱和正辛醇溶液的配制 精密量取等体积的不同pH值的PBS和正辛醇混合，置于恒温振荡器中，在37 ℃下，以100 r·min-1震荡4 h，静置分层后取上下层溶液，上层即为水饱和正辛醇溶液，下层为正辛醇饱和PBS溶液。

2.4方法学验证

2.4.1专属性验证 在上述“2.1”项色谱条件下，三叶苷对照品溶液及样品溶液色谱峰均分离良好，根据三叶苷分子式C21H24O10，相对分子质量436.14，得到离子峰M+H：437.14，提取的离子流图谱中无杂质干扰，保留时间5.17 min(图1)。

A.空白溶剂色谱图；B.三叶苷对照品提取的离子流色谱图；C.三叶苷对照品质谱图。

2.4.2线性关系考察 精密吸取三叶苷对照品储备液，用甲醇稀释，浓度分别为1030，686.7，515.0，257.5，128.8，64.4，32.2，16.1 ng·mL-1，在本研究检测条件下测定三叶苷对照品的峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标，浓度为横坐标(X)进行线性回归，绘制标准曲线，得线性回归方程为Y=40.26X+52.31。表明在本研究色谱条件下，三叶苷在16.1～1030 ng·mL-1浓度范围内，药物浓度与峰面积线性良好(R2=0.999 5)。

2.4.3精密度实验 精密吸取三叶苷对照品储备液，稀释成高、中、低(686.7，128.8，42.9 ng·mL-1)浓度，分别日内连续进样3次记录峰面积，计算测定的浓度和RSD，考察日内精密度；另将上述3个对照品连续进样3 d，计算测定浓度和RSD，考察日间精密度。结果如表1所示，其日内、日间RSD均在3%以下，表明该方法精密度良好。

表1 三叶苷日内、日间精密度结果

2.4.4稳定性实验 精密吸取三叶苷储备液，稀释成高、中、低3个浓度，分成两组，分别置于4 ℃和25 ℃条件下避光保存，放置7 d，在第1，3，5，7天取样，按本研究色谱条件测定得峰面积，通过回归方程计算其浓度，计算RSD%。

结果显示(表2)，三叶苷在4 ℃放置1周，其浓度无显著降低(RSD< 3%)，稳定性好；而三叶苷在25 ℃放置1周后，浓度逐渐降低(RSD> 5%)，表明三叶苷在室温条件下降解。因此，三叶苷配制成溶液后，应放置于4 ℃环境并避光保存。

表2 三叶苷在4 ℃和25 ℃的稳定性

2.4.5重复性及回收率实验 精密吸取三叶苷储备液，稀释成同一浓度的对照品溶液6份，在本研究色谱条件下进样检测，记录峰面积，计算测定的浓度和RSD，结果测得对照品含量的RSD为0.38%，表明该方法重复性良好。

取已知浓度的三叶苷储备液3份，分别向其中加入高、中、低浓度的三叶苷对照品溶液，按本研究色谱条件测定峰面积，计算高、中、低浓度的加样回收率分别为(93.79±0.54)%，(90.62±0.38)%，(87.13±0.74)%，RSD均<5%，表明其回收率符合含量测定要求。

2.5三叶苷平衡溶解度的测定 称取过量的三叶苷对照品，加入不同pH值的PBS中，制备三叶苷过饱和溶液，置于37 ℃恒温摇床中，以100 r·min-1振荡24 h后，将其转移至离心管，12 000 r·min-1离心15 min(r=7 cm)，取上清液，用甲醇稀释，经微孔滤膜滤过后，取样进行UPLC-MS/MS分析，结果pH值1.2，2.0，4.5，6.5，7.5，9.0，10.5，12.0的PBS中三叶苷平衡溶解度分别为0.90，1.16，1.83，2.72，3.91，11.73，15.51，23.79 mg·mL-1。可见，三叶苷的溶解度具有pH值依赖性，随着pH值的增加而显著增大。按照2015年版《中华人民共和国药典》规定，在pH值 1.2的缓冲液中，三叶苷极微溶解；在接近体内肠液pH值的缓冲液(pH值 6.5)中显示为微溶；当pH值为碱性溶液(pH值 >9.0)时，三叶苷溶解度急剧增大，在pH值 12.0时，其最大溶解度为23.79 mg·mL-1，表明三叶苷为难溶性药物，其在生理环境中溶解度较差。

另取上清液稀释，用紫外分光光度计进行吸收波长扫描，考察不同pH值溶液中三叶苷紫外吸收波长的变化(图2)。

图2 三叶苷在不同pH值溶液中的紫外吸收光谱

结果显示，三叶苷的最大吸收波长(220，284 nm)均随pH值变化发生了偏移，尤其在284 nm处，随着pH值增大，最大吸收峰波长显著向长波方向移动，进一步表明三叶苷的溶解度受溶液pH值的显著影响。

2.6三叶苷表观油水分配系数的测定 称取过量的三叶苷对照品加入正辛醇溶液中，饱和至溶液出现浅黄色沉淀，置于37 ℃恒温振荡器中振荡，静置后3000 r·min-1离心5 min(r=7 cm)，取上清液经孔径0.45 μm滤膜滤过，滤液稀释300倍后，取样品溶液进行UPLC-MS/MS分析，记录峰面积，计算三叶苷在正辛醇相中的初始浓度。

精密量取三叶苷饱和的正辛醇溶液加入棕色量瓶中，再分别加入不同pH值的正辛醇饱和PBS溶液，定容。将量瓶置于37 ℃恒温振荡器中，振摇6 h后，3000 r·min-1条件下离心5 min(r=7 cm)分层，取下层水溶液，经孔径0.45 μm滤膜滤过，滤液稀释100倍，取100 μL样品溶液进行UPLC-MS/MS分析，记录峰面积，计算三叶苷浓度。根据以下公式计算表观油水分配系数Papp，并求对数值lgP。

Papp为三叶苷的表观油水分配系数；C0为正辛醇相中三叶苷的初始浓度；V0为水饱和的正辛醇体积；Cw为药物分配平衡时测得水相中三叶苷的浓度；Vw为水相体积。

结果如图3所示，三叶苷的表观油水分配系数lgP值随溶液pH值上升而减小，在酸性或偏酸性溶液中(pH值=1.2～5.5)，lgP在0.15～0.26之间；pH值=7.5时，其lgP为0.03；pH值>8.5时，lgP<0，表明三叶苷在碱性条件下亲水性增加。

图3 三叶苷的表观油水分配系数

3 讨论

平衡溶解度和油水分配系数是药物的重要理化参数，二者会直接影响药物在体内的吸收程度及速度[7]。药物溶解是其在生物体内吸收的重要前提，溶解度小的药物常常存在吸收困难的问题，本研究结果显示，三叶苷在酸性及中性环境中溶解度均极低，在pH值 12.0时，最大溶解度为23.79 mg·mL-1，表明三叶苷为难溶性药物，其在胃肠道生理环境下溶解性较差，推测其口服吸收效率低。

药物的结构会直接影响其在不同pH值溶液中的溶解程度，三叶苷含有酚羟基结构，碱性溶液会促进酚羟基解离而增加溶解度。本研究结果表明三叶苷的溶解度随着pH值升高而显著增大。紫外分光光度计进行全波长扫描结果进一步显示，三叶苷的最大吸收波长(284 nm)随着pH值增加而显著向长波方向移动，推测三叶苷在碱性溶液中解离程度高于酸性溶液，其溶液中以分子和离子状态存在的含量不同而导致。

表观油水分配系数是预测药物膜渗透能力的重要理化参数，尤其在药物的肠吸收过程中，要求药物具有合适的脂溶性和水溶性[8]。lgP值对于胃肠道中药物的吸收速率有显著影响，当lgP值>5，药物脂溶性太强，水溶性低，肠道吸收后难以进入血液或淋巴液中；而lgP值较低(1gP<-2)时，药物水溶性强，脂溶性低，不能穿过细胞脂质膜而难以吸收；理想的药物lgP值为-1.0

药物在有机相和水相中分配过程相当复杂，其在水相中可发生酸式或碱式解离，了解不同pH值条件下的表观油水分配系数具有重要意义。本研究结果显示，在pH值梯度变化的PBS溶液中，三叶苷的表观油水分配系数随着pH值上升而减小，在酸性或偏酸性条件下lgP>0；在碱性条件下，lgP<0。因此，三叶苷在pH值偏高的肠段可能发生解离，脂溶性减小，导致膜通过效率降低。

在口服吸收过程中，药物在胃肠道的溶出及肠壁上的通透性至关重要，本研究根据胃肠道pH值的梯度变化，测定了三叶苷在不同 pH值缓冲液的平衡溶解度和油水分配系数，为后续药物吸收代谢研究以及新制剂、新剂型的研发提供了重要依据。同时，本研究结果表明，三叶苷体内溶解性低，lgP推测其膜通过性较好，因此，需要采用适当的制剂手段改善其体内溶解性，有效提高其口服生物利用度，从而更好地进行药理、药效学评价。