八珍益智方改善老年小鼠轻度认知功能障碍初步功效评价研究*

茆春阳，杜燕，周波，牛阳，王荣，李亚荣，马飞云

1 宁夏医科大学 宁夏银川 750004

2 济宁医学院 山东济宁 272000

轻度 认 知 障 碍（Mild Cognitive Impairment MCI）[1]是指记忆力或其他认知功能进行性减退，但不影响日常生活能力，且未达到痴呆的诊断标准。每年约有10%～30%患者发展为MCI[2]，约20%～66%MCI患者在2～4年内进展为痴呆[3]。随着人口老龄化速度的加快，和该病病程长、病理改变不可逆转以及缺乏有效的治疗手段等问题，已经成为影响人们生活质量的重要因素。八珍益智方来源于《成方便读》，具有增强智力、延缓衰老的功效[4]。该疾病在西医治疗方面方法较单一、疗效不显著，而中医药在延缓衰老、增强记忆力等方面有西药不可替代的优势。本研究发挥中医药多途径、多靶点的整体治疗优势，通过观察老年小鼠轻度认知功能障碍改善情况，探讨八珍益智方的功效。从而在该疾病治疗方面走出一条新路，体现中医“未病先防，既病防变”的思想。

材料与方法

1 动物

昆明种小鼠（2月龄）20只，体重（22g±2）g，雌雄各半，昆明种小鼠（16月龄）100只，体重（36g±5）g，雌雄各半，由宁夏医科大学动物中心提供。

2 药物与试剂

八珍益智方，组成为龙眼肉30g、莲子肉15g，茯苓 30g，山药 30g，白术 15g，芡实 15g，陈皮 15g，炙甘草15g，由宁夏医科大学药学院提供，方中所用药材去除杂质，按方剂组方量配比，煎煮，滤取煎液后浓缩至药液含生药 12.5ml/kg、25ml/kg、50ml/kg；脑复康片（吡拉西坦片）（东北制药总厂，0.4g/片，批号：国药准字H21021775）。

3 仪器

避暗箱、跳台仪，淮北正华设备有限公司。

4 造模方法

参考周晓密[5]轻度认知功能障碍小鼠模型的制备，将16月龄小鼠于术前8～12h禁食，期间可自由饮水，用10%水合氯醛（3mL/kg，腹腔注射）将其麻醉后，仰卧位固定于手术台上，随后将颈部皮肤剪毛备皮并用活力碘消毒，行颈侧向切口，仔细分离皮肤和肌肉，显露并游离双侧颈总动脉，在颈总动脉近心侧距颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA）分叉处约1.5cm处用0号手术缝合线将颈总动脉和直径0.45mm的注射器针头一并仔细扎紧丝线打成活结，然后小心拔出针头，缝合伤口，造成脑持续性低灌注。术后每日肌注青霉素1.6万U，连续3d，抗感染。

5 分组与处理

5.1 避暗试验 取16月龄老年模型小鼠50只，随机分为5组，即老年对照组、脑复康阳性对照组（0.6 g/kg）、八珍益智方剂低剂量组（12.5 ml/kg）、中剂量组（25 ml/kg）和高剂量组（50 ml/kg），每组 10 只。另取10只青年小鼠作青年对照组。青年对照组和老年对照组均灌服等容积生理盐水。各组每日灌胃1次，连续给药21d，于末次给药后1h用避暗法进行测试，将小鼠尾对暗室放入，小鼠钻洞进入暗室遭电击因而获得记忆，24h后测试记忆功能，以钻洞潜伏期（即小鼠自放入明室至钻入暗室遭电击的时间，记作潜伏期）和5 min内钻洞次数（即错误数）作指标。

5.2 跳台试验 取16月龄老年模型小鼠50只，随机分为5组，即老年对照组、脑复康阳性对照组（0.6g/kg）、八珍益智方低剂量组（12.5 ml/kg）、中剂量组（25 ml/kg）和高剂量组（50ml/kg），每组10只。另取10只青年小鼠作青年对照组。青年对照组和老年对照组均灌服等容积生理盐水。各组每日灌胃1次，连续给药21d，于末次给药后1h用跳台法进行测试，用跳台法训练小鼠，训练前10min除对照组外，训练5 min，24 h后复测，记录小鼠自放入跳台至第1次跳下时间（即触电潜伏期）和5 min内触电次数（错误数）作指标。

6 统计学方法

数据采用SPSS23.0统计软件分析处理，所有计量资料均以（±s）表示，各组间比较采用两样本均数t检验，等级资料采用秩和检验。P<0.05为差别有统计学意义。

结 果

1 八珍益智方对老年小鼠认知功能的影响（避暗试验）

与青年对照组相比，老年对照组小鼠认知功能明显减退，差异极其显著（P<0.01）；八珍益智方和脑复康4组均能改善老年小鼠的认知功能，与老年对照组相比，有统计学差异（P<0.05），且八珍益智方剂中、高剂量组优于脑复康组。见表1。

表1 八珍益智方对老年小鼠学习记忆功能的影响（避暗法，±s）

表1 八珍益智方对老年小鼠学习记忆功能的影响（避暗法，±s）

注：与老年对照组比较：**P<0.05，***P<0.001；与脑复康组比较：△P<0.05

组别 只数 剂量/ml·kg-1 潜伏期/s 5 min内错误数/次青年对照组 10 NS（等容积） 236±121*** 0.6±0.5***老年对照组 10 NS（等容积） 48.4±21.6 2.5±0.7脑复康组 10 0.6 142±113** 0.9±0.6**八珍组（低） 10 12.5 164±106** 0.7±0.5**八珍组（中） 10 25 234±135*** 0.5±0.5***△八珍组（高） 10 50 241±142***△ 0.4±0.5***△

2 八珍益智方剂对老年小鼠认知功能的影响（跳台试验）

与青年对照组相比，老年对照组小鼠认知功能明显减退，差异极其显著（P<0.01）；而八珍益智方和脑复康两组均能改善老年小鼠的认知功能，与老年对照组相比，有统计学差异（P<0.05），且八珍益智方剂中、高剂量组优于脑复康组。见表2。

表2 八珍益智方对老年小鼠学习记忆功能的影响（跳台法，±s）

表2 八珍益智方对老年小鼠学习记忆功能的影响（跳台法，±s）

注：与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与脑复康组比较：△P<0.05。

组别 只数 剂量/ml·kg-1 潜伏期/s 5 min内错误数/次青年对照组 10 NS（等容积） 215±35.2** 0.8±0.5**老年对照组 10 NS（等容积） 64.1±40.3 2.2±0.4脑复康组 10 0.6 14.8±51.4* 1.0±0.6**八珍组（低） 10 12.5 10.6±57.5** 0.9±0.6**八珍组（中） 10 25 218±42.4**△ 0.6±0.7***△八珍组（高） 10 50 226±62.1**△ 0.6±0.5***△

讨 论

轻度认知功能障碍（MCI）是介于正常老化和老年痴呆之间的状态，主要表现为认知功能下降，记忆力减退，视空间技能损害等，且呈进行性加重的过程。结合MCI临床表现，祖国医学将其归属为“痴呆、健忘、呆病、神病”等范畴[6-7]，历代大多医家认为轻度认知功能障碍当从虚、实两方面论治，虚者多为髓海不足和脾肾两虚；实者多为痰浊蒙窍和瘀血内阻。肾为先天之本，主藏精，生髓，髓属营养之物，至清至纯，上通于脑。《内经》云“人始生，先成精，精成而脑髓生。”脑为髓之海，脑髓有赖于肾精的不断生化。肾精充足，髓海得养，脑发育健全，则可见思维敏捷，精力充沛；反之，肾精不足，髓海空虚，脑失所养，可出现脑转耳鸣，痉痠眩冒，懈怠安卧。《医方集解》曰：“人之精与志，皆藏于肾，肾精不足则肾气衰，不能上通于心，故迷惑善忘也。”《三因极一病证方论》云：“脾主意与思，意者记所往事，思则兼心之所为。”周永红[8]认为，脑髓的充足与否决定脑的功能，脑萎髓空、神机失用是MCI的基本病机。关徐涛等[9]“五脏致呆”理论中提出若脾失运化，清阳之气无力上升，则可出现健忘之症；肾虚髓空，脑失充养，则出现灵机记性减退。《灵枢·经脉》曰：“水足髓充，则元神清湛而强记不忘矣。”在中医学中，肾为先天之本，脾为后天之本，可以对人的神志起到关键作用，因此，在治疗上当以填精补髓，补肾健脾为主。临床中关于中医药治疗MCI研究较多，且疗效显著。何迎春[10]研究发现，运用健脾填精法治疗MCI，其临床有效率达到86.7%，并能降低MCI向痴呆的转化率，且无不良反应，为MCI防治提供了新思路。夏明磊等[11]建立血管性痴呆大鼠模型，通过观察增智方组大鼠学习记忆功能，发现增智方能明显提高血管性痴呆模型大鼠学习记忆能力，并能降低降低血浆 ET含量和升高NO含量。有相关证据提示[12]，遗忘型轻度认知障碍患者中存在外周炎性因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α等升高。谢淑玲等[13]认为遗忘型轻度认知障碍以肾虚痰瘀为主要病机，同时发现中枢神经系统与外周免疫系统之间有可能存在一定的联系，经过长期临床总结的益智安神方在治疗aMCI肾虚痰瘀证中，能够降低aMCI向AD的转化率，降低IL-1β、IL-6炎性水平，从而达到改善患者整体认知功能水平。侯燕等[14]在临床中运用益智散穴位贴敷联合补元聪脑方治疗MCI，观察其疗效发现此方法可以预防MCI，并能降低患者血清Aβ1－42及P－tau水平。黄舒文、张彪[15]记载的医案中运用补肾益智方加减治疗脾肾两虚证老年轻度认知功能障碍，可以改善患者认知功能，提高临床疗效。

八珍益智方处方源于《成方便读》，也是课题组在长期临床中总结提出的经验方，由龙眼肉、茯苓、莲子肉、山药、白术、芡实、陈皮、炙甘草8味药组成，具有增强智力、延缓衰老的功效。祖国医学认为，心主神志，脾藏意主思，又为后天之本，肾主藏精，为先天之本，故健忘、神志不安等症与心、脾、肾的关系最为密切。本方重用龙眼肉为君药，其性平味甘，有“开胃健脾，补虚益智”等功效，《神农本草经》称其：“主安志，厌食，久服强魂魄，聪明”；有关龙眼肉药理学研究发现，龙眼肉具有抗衰老和增强免疫力作用[16]。骆萍等[17]研究显示，龙眼肉水提取物的抗氧化活性可以显著改善东莨菪碱所致大鼠学习记忆获得性障碍。臣药以茯苓健脾安神，能利窍去湿，利窍则开心益智，导浊生津，《本草正》称“茯苓，能利窍去湿，利窍则开心益智，导浊生津 ”易延逵等[18]研究证明，龙眼肉、茯苓等复合物能改善大大鼠的记忆。莲子肉甘涩而平，既能补脾养心，又可益肾固精，均为臣药，《本草经集注》[19]记载：“主补中、养神、益气力，久服轻身，耐老，不饥，延年。”佐以山药既补脾气，又益脾阴，且能补肾填精，《日华子本草》称其“主泄精，健忘”，可增强龙眼肉补益心脾之力；王邈等[20]通过对山药的药理作用分析发现，山药具有抗衰老和调节免疫功能作用。芡实性味甘平而涩，能补脾益肾而固精气；李云等[21]研究证明，山药、芡实药对可以通过改善免疫功能使其达到健脾益气功效，并且最佳配比2﹕1，为临床中30g﹕15g。佐以白术健脾益气，其药理作用具有抗衰老作用[22]；陈皮理气调中，以助君药补脾之功。炙甘草为佐使之用，既能助龙眼肉、茯苓、白术以补脾气，又可调和诸药。

八珍益智方方中大多数药物药性多平，《神农本草经》中延年益寿药物多以性平，是略偏盛的阴阳气血逐渐趋于平衡，以达到“阴平阳秘”状态，发挥延年益寿作用[23]。本研究结果显示，八珍益智方中诸药相伍，共奏填精补肾、健脾益智之效，能够有效改善老年小鼠轻度认知功能障碍，达到增强智力、延缓衰老的功效，同时也为进一步更系统的实验验证以及后期临床试验提供了理论依据。下一步我们将进行八珍益智方临床试验，对预防轻度认知功能障碍发展为老年痴呆具有重大意义，从而发挥中医药“治未病”思想。