活血化瘀法对膝骨性关节炎模型兔基质金属蛋白酶的影响

余毅 张婷 熊逸啸 向振 欧广洋 潘波 刘剑 徐仪昕 刘雅娟 李梅琪 余望贻

〔摘要〕 目的 研究活血化瘀法對膝骨性关节炎模型兔基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase， MMPs）的影响。方法 将32只新西兰兔分为对照组、模型组、中药组、阳性药组，每组8只。采用改良Hulth造模法建立兔膝骨性关节炎模型，给予药物治疗28 d。中药组给予活血化瘀合剂（1.4 g/kg），阳性药组给予硫酸氨基葡萄糖溶液（0.07 mg/kg），对照组及模型组给予等体积蒸馏水。给药结束后，取兔右后膝关节软骨行HE染色，用于组织病理分析;收集关节液，采用ELISA法检测MMP-3、MMP-9、MMP-13的含量;采用Western blot和RT-qPCR法分别检测兔关节软骨MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白及mRNA水平。结果 与对照组比较，模型组兔关节软骨存在浅表层纤维化，软骨细胞成簇、排列无规则、部分坏死，滑膜增厚，基质染色丢失等病理现象，关节液MMP-3、MMP-9、MMP-13含量较对照组显著升高（P<0.01），其蛋白及mRNA表达在关节软骨中也显著上升（P<0.01）;与模型组比较，中药组兔关节软骨病理损伤得以缓解，关节液MMP-3、MMP-9、MMP-13含量明显下降（P<0.01或P<0.05），关节软骨MMP-3、MMP-9蛋白及mRNA表达均下调（P<0.01），MMP-13 mRNA表达下调（P<0.05）;与中药组比较，阳性药组MMP-13 mRNA表达水平显著降低（P<0.05）。结论 活血化瘀法能缓解膝骨性关节炎模型兔关节软骨的损伤，其机制可能与抑制MMPs的表达，尤其是MMP-3和MMP-9表达有关。

〔关键词〕 膝骨性关节炎;活血化瘀;基质金属蛋白酶;关节软骨;关节液

〔中图分类号〕R255.6       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.07.005

〔Abstract〕 Objective To study the effects of Huoxue Huayu method on matrix metalloproteinase （MMPs） in rabbit model of knee osteoarthritis. Methods 32 New Zealand rabbits were divided into control group， model group， Chinese medicine group and positive drug group， with 8 rats in each group. A rabbit model of knee osteoarthritis was established by modified Hulth modeling method， followed by drug treatment for 28 days. The Chinese medicine group was given Huoxue Huayu Mixture （1.4 g/kg）， the positive drug group was given glucosamine sulfate solution （0.07 mg/kg）， and the control group and the model group were given equal volume of distilled water. At the end of the administration， rabbit right posterior knee articular cartilage was taken for histopathological analysis through HE staining， and the content of MMP-3， MMP-9 and MMP-13 of synovial fluid was detected by ELISA; Western blot and RT-qPCR were used to detect MMP-3， MMP-9， MMP-13 protein and mRNA levels in rabbit articular cartilage. Results There were superficial fibrosis in the articular cartilage of rabbits in the model group compared with the control group， the chondrocytes were clustered， arranged irregularly， partially necrotic， thickened synovial， and lost in matrix staining， the content of MMP-3， MMP-9 and MMP-13 in synovial fluid was higher than control group （P<0.01）， and the protein and mRNA expression in the articular cartilage also increased significantly （P<0.01）; compared with the model group， the pathological damage of rabbit articular cartilage of Chinese medicine group was relieved， and the content of MMP-3， MMP-9 and MMP-13 in joint fluid decreased significantly （P<0.01 or P<0.05）， articular cartilage MMP-3， MMP-9 protein and mRNA expression were down-regulated （P<0.01）， and MMP-13 mRNA expression was down-regulated （P<0.05）; compared with the Chinese medicine group， MMP-13 mRNA expression in positive drug group was down-regulated （P<0.05）. Conclusion Huoxue Huayu method can alleviate the damage of articular cartilage in rabbits with knee osteoarthritis model， and its mechanism may be related to the inhibition of MMPs expression， especially the expression of MMP-3 and MMP-9.

〔Keywords〕 knee osteoarthritis; Huoxue Huayu; matrix metalloproteinase; articular cartilage; joint fluid

膝骨性关节炎是由于膝关节局部损伤、炎症或慢性劳损引起的软骨变性及活动障碍的慢性退行性骨关节病，在老年人中患病率高达50%[1]。软骨组织损伤是膝骨性关节炎的重要病理特征，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase， MMPs）在软骨基质降解过程中发挥了关键作用[2-3]。因而，抑制MMPs表达能保护软骨组织，恢复膝骨关节的正常活动。膝骨性关节炎属中医学“痹证”范畴，气滞血瘀是其主要病机，治宜活血化瘀，基于此理法而成的消炎散是湖南中医药大学第一附属医院院内制剂，已使用40余年，全方由近20味中藥组成，具活血凉血、散瘀止痛之功，临床疗效显著[4]。本研究选用消炎散中主要的活血化瘀中药“当归、赤芍、姜黄”组成活血化瘀合剂，通过建立膝骨性关节炎动物模型，明确活血化瘀法治疗膝骨性关节炎的作用特点，并以MMPs为切入点，阐明其分子机制。

1 材料与方法

1.1  实验动物

32只SPF级健康新西兰兔，体质量2.0～2.5 kg，雌雄各半，由湖南中医药大学实验动物中心代购，使用许可证号为SKYK（湘）2019-0009。

1.2  实验药物

活血化瘀合剂药物组成：当归10 g，赤芍10 g，姜黄10 g，原药材均购自湖南中医药大学第一附属医院。全方煎煮2次，第1次加10倍量水、第2次加8倍量水，每次煎煮1.5 h，合并水煎液，浓缩至终质量浓度为含生药量1.3 g/mL，保存备用。硫酸氨基葡萄糖（伊索佳）购自新兴同仁药业有限公司，批号：18092602，规格：0.25 g×12粒，国药准字号H20041317。

1.3  主要试剂与仪器

MMP-3、MMP-9、MMP-13 ELISA试剂盒（批号：CSB-E09269Rb、CSB-E06933Rb、CSB-E14220Rb，武汉华美生物工程有限公司）;MMP-3、MMP-9、MMP-13一抗（批号：14351S、13667S、69926S，美国CST中国分公司）;反转录试剂盒（批号：740703，日本Takara有限公司）;苏木精、伊红（批号：ZLI-3301、ZLI-9613，北京中杉金桥生物技术有限公司）。

RM223切片机、DMi1倒置光学显微镜（德国Leica公司）;MK3酶标仪（美国Themo中国有限公司）;CFX96荧光定量PCR仪、ChemiDoc XRS+化学发光成像系统（美国Bio-Rad生物科技有限公司）。

1.4  动物分组、造模与给药

将32只新西兰兔随机分为对照组、模型组、中药组、阳性药组，每组8只。除对照组外，均采用改良的Hulth造模法建立兔膝骨性关节炎模型[5]。耳缘静脉注射20%的乌拉坦（4 mL/kg）麻醉兔，固定，取右侧后腿膝关节，常规脱毛、消毒，使膝关节屈曲，沿兔膝关节内侧入路，使内侧副韧带及前交叉韧带完全离断。经前抽屉试验、内侧应力试验验证韧带完全离断后，充分冲洗创口，逐层缝合，术后连续3 d注射青霉素。对照组不切开关节囊，用盐水冲洗后缝合。术后预防感染。造模后4周随机挑选3只动物进行X线片检查，X线下见兔右膝关节间隙变窄、关节面呈高密度影、关节周围骨赘形成，提示造模成功[5]。造模成功后开始灌胃给药，给药量按照70 kg成人与1.5 kg兔体表面积等效换算（成人剂量×70 kg×0.07/1.5 g/kg）。中药组给予临床等效剂量的活血化瘀合剂（1.4 g/kg），阳性药组给予临床等效剂量的硫酸氨基葡萄糖溶液（0.07 g/kg），对照组及模型组给予等体积蒸馏水，均持续给药28 d。

1.5  动物处理

实验过程中共有5只动物死亡，其中模型组2只，中药组2只，阳性药组1只。末次给药完成后，采用空气栓塞法处死动物，取右后膝后髌上囊处常规脱毛，作长约0.5 cm的纵形切口，用1 mL生理盐水灌洗关节腔3次后，收集关节液，而后切除右后膝关节软骨，切断软骨，一半置于4%多聚甲醛中固定，一半保存于液氮中。

1.6  HE染色观察兔关节软骨病理损伤情况

取固定的兔关节软骨，常规石蜡包埋后切片，经脱蜡、水化后进行HE染色，脱水、透明、封片，装盒待用。于光学显微镜下观察、拍照，分析病理损伤情况，并在光镜下对切片进行Mankin评分[6]，Mankin评分用来评价软骨组织病理变化程度，包含对软骨结构（0～6分）、软骨细胞（0～3分）、基质染色（0～3分）、潮线（0～1分）等方面的观察判定，评分越高，提示软骨受损程度越严重。每个样本取3次评分的平均值。

1.7  ELISA检测兔关节液MMPs含量

收集关节液后，于4 ℃、4 000  r/min条件下离心10 min（离心半径6 cm），取上清液。根据ELISA试剂盒说明书的详细步骤进行实验操作，检测右膝关节液中MMP-3、MMP-9、MMP-13的含量。

1.8  Western blot检测兔关节软骨组织MMPs蛋白表达水平

取兔关节软骨组织，匀浆，测定总蛋白含量。制备分离胶和浓缩胶，蛋白变性，上样，SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭，裁剪条带，加入稀释后的一抗（按1∶1 000稀释），4 ℃孵育过夜。洗涤条带，加入二抗室温下孵育4 h，洗涤条带，化学发光法显影。采用Image J成像软件分析条带灰度值，以GAPDH为内参蛋白，计算关节软骨中MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白的相对表达水平。

1.9  RT-qPCR检测兔关节软骨组织MMPs mRNA表达水平

取兔关节软骨组织，加入Trizol试剂，匀浆，提取组织总RNA，并进行含量检测。根据反转录试剂盒操作步骤将RNA逆转录成cDNA，之后进行PCR反应扩增目的基因，扩增条件为：95 ℃ 15 min预变性，95 ℃ 10 s变性，60 ℃ 30 s退火延伸，35个循环，以β-actin基因为内参。引物由深圳华大基因公司合成，序列见表1。

1.10  统计学分析

所有的实验数据均以“x±s”表示，用SPSS 19.0软件进行数据分析。所有数据均符合正态分布，方差齐者采用单因素方差分析，多重比较用LSD检验，方差不齐时用TambaneS T2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1  各组兔关节软骨HE染色情况

对照组兔关节软骨结构清晰，表面光滑，细胞排列整齐，基质染色基本均匀;模型组软骨浅表层纤维化，软骨细胞成簇、排列无规则、部分坏死，滑膜增厚，基质染色丢失;中药组及阳性药组关节软骨表层偶见少量簇集的软骨细胞，无细胞坏死，滑膜稍微增厚，基质染色尚可。Mankin评分结果显示，与对照组比较，模型组、中药组、阳性药组兔软骨组织评分均显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;与模型组比较，中药组及阳性药组评分显著下降，差异均有统计学意义（P<0.01）;中药组与阳性药组比较，评分差异无统计学意义（P>0.05）。见图1、表2。

2.2  各组兔关节液MMPs含量比较

与对照组比较，模型组、中药组及阳性药组关节液MMP-3、MMP-9、MMP-13含量均显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;与模型组比较，中药组及阳性药组关节液MMP-3、MMP-9、MMP-13含量显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;中藥组与阳性药组比较，MMP-3、MMP-9、MMP-13含量差异均无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.3  各组兔关节软骨MMPs蛋白表达水平比较

与对照组比较，模型组及阳性药组关节软骨MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白表达水平均显著升高，中药组MMP-3、MMP-13表达升高，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;与模型组比较，中药组MMP-3、MMP-9表达水平显著降低，差异均有统计学意义（P<0.01），MMP-13降低，但差异无统计学意义（P>0.05）;与模型组比较，阳性药组MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白表达水平显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;中药组与阳性药组比较，MMP-3、MMP-9、MMP-13表达差异均无统计学意义（P>0.05）。见图2、表4。

2.4  各组兔关节软骨MMPs mRNA表达水平比较

与对照组比较，模型组、中药组及阳性药组关节软骨MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表达水平均显著升高，差异均有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，中药组及阳性药组MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表达水平明显降低，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;与中药组比较，阳性药组MMP-13 mRNA表达水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表5。

3 讨论

膝骨性关节炎属中医学“痹证”范畴，与“痹病”“骨痹”类似，是由于风、寒、湿邪独立或合而入侵致经络闭阻、气血不通而发生。《素问·痹论》云：“风寒湿三气杂至，合而为痹也。”该病多发于中老年人群，是由于其长期劳损、气血不足，累及筋骨关节，致气血不和、瘀血内生、阻塞经络、瘀热互结，故而成痹。清代医家王清任的《医林改错》中明确提出“痹有瘀血”，提示可用活血化瘀法治疗痹证。课题组前期运用活血化瘀法治疗膝骨性关节炎已取得良好的疗效，以当归、赤芍、姜黄为主要活血化瘀药物的消炎散治疗瘀阻脉络、气滞血瘀型关节炎疗效尤为明显[7]。当归、赤芍是临床常用的活血补血药对，当归味甘而重，气轻而辛，专补血行血，为血中气药，又通经活络，常用于治疗瘀血肿痛、跌打损伤、风湿痹痛等;赤芍苦而微寒，善清热凉血、散瘀止痛，主治瘀滞经闭、胁痛、跌扑损伤;姜黄可破血行气、通经止痛，常用于跌打损伤。临床与基础研究均证实，活血化瘀合剂对膝骨关节炎有良好的治疗效果[8-9]。

膝骨性关节炎的关键病理特征之一是软骨细胞的大量降解，而关节软骨主要由细胞外基质组成，抑制基质降解和软骨细胞凋亡被认为是治疗膝骨性关节炎的关键[10]。MMPs是基质合成和降解的关键调节因子，其过量表达会加速软骨基质中蛋白聚糖的分解，并促进软骨细胞凋亡，诱发疾病的发生[11]。MMP-9是与骨关节炎发生联系最为紧密的MMPs亚型，其含量的异常升高与其组织金属蛋白酶抑制剂水平的相对下降与骨性关节炎的软骨退变过程密切相关[12];同时，MMP-3和MMP-13表达的异常在膝骨性关节炎的发生发展中发挥了重要作用[13]。此外，MMP-1、MMP-7等亚型也被报道参与了膝骨疾病的发生[14-15]。由此可见，MMPs多种亚型均参与了关节软骨退变过程，但MMP-3、MMP-9和MMP-13可能在疾病发生过程中扮演了更为关键的角色。RYU JH等[16]研究发现，炎症因子在与其受体结合后会通过激活细胞外信号调节酶相关通路，诱导软骨组织释放MMP-3、MMP-9及MMP-13，增加II型胶原和聚集蛋白聚糖的剪切和降解，破坏关节软骨。

本研究中，膝骨性关节炎模型兔关节软骨病理损伤明显，软骨细胞成簇肥大、排列紊乱、部分细胞凋亡甚至坏死，滑膜增厚。与对照组比较，模型组软骨组织Mankin评分、关节液及关节软骨中MMPs含量均显著升高（P<0.05或P<0.01）;与模型组比较，中药组及阳性药组软骨组织Mankin评分、关节液及关节软骨中MMPs含量显著下降（P<0.05或P<0.01）。硫酸氨基葡萄糖为天然的氨基单糖，是人体关节软骨基质中合成蛋白聚糖的必需成分，临床广泛用于预防和治疗各种类型的骨性关节炎，研究[17-18]表明，硫酸氨基葡萄糖可参与抗氧化、抗炎，并抑制MMPs、氧化自由基的形成，预防糖皮质激素及非甾体抗炎药对关节软骨细胞的损害。本研究结果也证实，硫酸氨基葡萄糖能够抑制膝骨性关节炎MMPs的产生，保护关节软骨细胞。

本研究结果提示，活血化瘀合剂能够缓解膝骨性关节炎模型兔关节软骨的病理损伤，其机制与抑制关节液及软骨中MMP-3、MMP-9、MMP-13水平有关。本研究证实活血化瘀法能通过调控MMPs水平发挥治疗膝骨性关节炎的功效，一定程度阐明了活血化瘀法的疗效机制，为其临床治疗膝骨性关节炎提供了良好的理论依据。

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