青光安Ⅱ号方对诱导损伤的RGC-5细胞中NF-κB/HIF-1α通路相关细胞因子的影响

姚小磊 时健 刘倩宏 陈立浩 侯念婷

〔摘要〕 目的 觀察青光安Ⅱ号方对谷氨酸诱导损伤的RGC-5细胞中核因子κB（nuclear factor kappa-B， NF-κB）、低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）、BCL2/腺病毒E1B相互作用蛋白3（BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3， BNIP3）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）及丙二醛（malondialdehyde， MDA）的影响。方法 体外培养RGC-5细胞，分为4组：空白组、模型组、含药血清组和阻断剂组。模型组、含药血清组和阻断剂组予以谷氨酸诱导细胞损伤，模拟青光眼对神经节细胞的损伤，含药血清组加入青光安Ⅱ号方含药血清，阻断剂组加入KC7F2进行HIF-1α通路的阻断。以CCK-8法摸索含药血浆以及谷氨酸的最佳干预浓度;采用Hoechst法检测各组细胞的凋亡情况;Western blot检测NF-κB、HIF-1α、BNIP3蛋白表达情况;比色法检测SOD、MDA的表达情况。结果 CCK8法确定青光安Ⅱ号方5倍组含药血清为实验量，确定谷氨酸的最佳干预浓度为200 μM。与空白组比较，模型组NF-κB、HIF-1α、BNIP3、SOD、MDA表达显著升高（P<0.05）;与模型组比较，含药血清组、阻断剂组NF-κB、HIF-1α、BNIP3和SOD的表达显著降低（P<0.05）;含药血清组与阻断剂组的NF-κB、HIF-1α、BNIP3、SOD及MDA差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 青光安Ⅱ号方对NF-κB具有抑制作用，进而抑制了HIF-1α相关通路的激活，减弱了由于氧化应激所致RGC-5细胞的凋亡，对RGC具有保护作用。

〔关键词〕 青光眼;青光安Ⅱ号方;视网膜神经节细胞;核因子κB;低氧诱导因子-1α;BCL2/腺病毒E1B相互作用蛋白3;超氧化物歧化酶;丙二醛

〔中图分类号〕R276.7       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.07.004

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Qingguangan Ⅱ Formula on nuclear factor kappa-B （NF-κB）， hypoxia inducible factor-1 （HIF-1α）， BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3 （BNIP3）， superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA） in RGC-5 cells injury induced by glutamate. Methods The RGC-5 cells cultured in vitro were divided into 4 groups： blank group， model group， drug-containing serum group and blocker group. Glutamic acid was added to model group， drug-containing serum group and blocker group to simulate retinal ganglion cell damage caused by glaucoma， and Qingguangan Ⅱ Formula serum was added to drug-containing serum group， and the blocker group was added with KC7F2 to block the HIF-1α pathway. The CCK-8 method was used to find optimal intervention concentration of drug-containing plasma and glutamate; Hoechst method was used to detect the apoptosis of cells in each group; Western blot was used to detect the expression of NF-κB， HIF-1α， BNIP3; colorimetry was used to detect the expression of SOD and MDA. Results CCK8 method determined 5 times serum content as the Qingguangan Ⅱ Formula experimental amount， and the optimal intervention concentration of glutamate was 200 μM. Compared with blank group， the expression of NF-κB， HIF-1α， BNIP3， SOD and MDA increased significantly in the model group （P<0.05）; compared with the model group， the expression of NF-κB， HIF-1α， BNIP3 and SOD in the drug-containing serum group and blocker group significantly decreased （P<0.05） ; there was no statistically significant difference between NF-κB， HIF-1α， BNIP3， SOD and MDA in drug-containing serum group and blocker group （P>0.05）. Conclusion Qingguangan II Formula has an inhibitory effect on NF-κB， thereby inhibiting the activation of HIF-1α related pathways， reducing the apoptosis of RGC-5 cells caused by oxidative stress， it also has a protective effect on RGC.

〔Keywords〕 Qingguangan Ⅱ Formula; retinal ganglion cell; nuclear factor kappa-B; hypoxia inducible factor-1; BCL2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3; superoxide dismutase; malondialdehyde

青光眼為导致人类失明的三大眼类疾病之一。调查显示，2020年全球青光眼患病人数高达7 600万，其中我国占2 100万，位居世界之首[1]，目前，超过40岁以上人群青光眼的总患病康复率仅有1.5%～3.6%[2]，治疗方案主要以控制眼压来保存视力，但是青光眼导致的视神经损伤却不可逆，且没有较好的视神经保护方案。彭清华教授通过多年临床经验总结出“青光安Ⅱ号方”，研究表明其有较好的临床疗效，尤其对青光眼术后仍存在视力下降的患者，有较好的视神经保护效应[3]，但其具体的机制并不清楚。动物实验中发现青光安Ⅱ号方对于Caspase-3有影响，可减少视网膜神经细胞的凋亡[4]。有研究表明，青光眼的视神经损伤可能与氧化应激有关[5-6]，活性氧的增加是小胶质细胞在高眼压过程中死亡的主要原因[7]。因此，本研究通过实验的方法探讨青光安Ⅱ号方对RGC-5细胞模型[8]中核因子κB（nuclear factor kappa-B， NF-κB）/低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1， HIF-1α）通路中相关因子的影响，以期明确其视神经保护的相关机制。

1 材料与方法

1.1  动物及细胞

取健康SPF级雄性和雌性SD大鼠各30只，由湖南省斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2019-2004，体质量0.17～0.28 kg。动物实验伦理合格证号：LL2019121901。RGC-5细胞株（批号：CP-M122，武汉普诺赛生命科技有限公司）。

1.2  药物

中药配方：黄芪（批号：CK19111807）、枸杞子（批号：SL19112203）、灯盏细辛（批号：2019011616）、牛膝（批号：CK19101401）、川芎（批号：SL19111503）、女贞子（批号：2019011201）均购自湖南中医药大学第一附属医院。

1.3  试剂与仪器

CCK-8试剂盒（批号：CA1210）、30%制胶液（批号：A1010）均购自索莱宝公司;总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）测定试剂盒（批号：A001-3-2）、丙二醛（malondialdehyde， MDA）测定试剂盒（批号：A003-1）均购自南京建成公司;Tris（中国医药集团有限公司，批号：30188216）;5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（批号：P0015L）、ECL发光液（批号：P0018S-2）均购自上海碧云天生物技术有限公司;蛋白Marker（赛默飞世尔科技公司，批号：26617）;PVDF膜（美国密理博公司，批号：IPVH00010）;膜再生液（北京普利莱基因技术有限公司，批号：P1650）;HIF-1α（批号：ab1）、BCL2/腺病毒E1B相互作用蛋白3（BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3，BNIP3）（批号：ab109362）、NF-κB（批号：ab16502）均购自上海Abcam生物技术有限公司;GAPDH（美国proteintech公司，批号：10494-1-AP）;羊抗兔-HRP（北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-0295G-HRP）;KC7F2（上海浩洋生物科技有限公司，批号：S7946）。

酶标仪（上海碧云天生物技术有限公司，型号：Synergy H4）;KHB洗板机（上海科华实验系统有限公司，型号：ST-36WT）;电泳仪（伯乐生命医学产品有限公司，型号：1645070）;电转仪（伯乐生命医学产品有限公司，型号：BE6085）;全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司，型号：5200）。

1.4  含药血清的获取

将60只SD大鼠随机分成青光安Ⅱ号方10倍组、青光安Ⅱ号方5倍组、青光安Ⅱ号方2.5倍组和空白组。按体表面积换算的方法计算出每只大鼠的灌药量，灌药大鼠均按照10倍成人等效剂量灌胃。适应性饲养1 d后开始灌胃，空白对照组灌同等剂量的生理盐水，每日1次。灌胃7 d后，提取血清。取血方法：每只大鼠麻醉前1 h灌胃，大鼠麻醉、固定，颈总动脉采血，离心提取含药血清和空白血清。青光安Ⅱ号方10倍组：所取血清即为高剂量血清;青光安Ⅱ号方5倍组：所取血清加入1倍体积DMEM低糖培养基，设为中剂量血清;青光安Ⅱ号方2.5倍组：所取血清加入3倍体积DMEM低糖培养基，设为低剂量血清。收集的血清56 ℃下灭活补体30 min，按组别混合后放-80 ℃冰箱保存。

1.5  含药血清加入量及谷氨酸加入量的摸索

采用CCK-8法确定含药血清及谷氨酸加入量。将细胞以2×104个/mL、200 μL/孔的密度接种在96孔板中，在37 ℃、5% CO2箱中培养24 h，移出孔板，分别加入0、25、100、200 μM的谷氨酸;继续放回37 ℃、5% CO2箱进行培养;24 h干预后取出96孔板;向每个孔中添加10 μL CCK-8反应溶液;在37 ℃、5% CO2箱中继续孵育2 h;用酶标仪测量450 nm处的吸光度（OD），并通过存活率判定各种浓度下的细胞增殖活性，由此选择适当的谷氨酸浓度。同时按照上述方法分别加入3种不同浓度的24 μL含药血清，通过存活率OD判定各种浓度下的细胞增殖活性。选择适当的含药血清浓度。

1.6  细胞模型建立及分组、干预

使用RGC-5细胞株，培养至状态良好，体外培养的RGC-5细胞分为4组。空白组：10%胎牛血清的DMEM低糖培养基加空白血清进行培养。模型组：细胞培养基中加入谷氨酸，以此模拟RGC-5细胞损伤[8]，10%胎牛血清的DMEM低糖培養基加空白血清进行培养。含药血清组：细胞培养基中加入谷氨酸，以此模拟RGC-5细胞损伤[8]，10%胎牛血清的DMEM低糖培养基加含药血清进行培养。阻断剂组：细胞培养基中加入谷氨酸，以此模拟RGC-5细胞损伤[8]，10%胎牛血清的DMEM低糖培养基加含药血清进行培养，合并使用阻断剂KC7F2[9]2 μM处理。

1.7  Hoechst染色法检测细胞凋亡

将细胞以2×104个/mL、2 mL/孔密度接种于6孔板爬片中，在37 ℃、5% CO2箱中培养24 h;取出孔板，按以上分组进行处理，先加入200 μM谷氨酸;继续在37 ℃、5% CO2箱中培养24 h;取出孔板，按以上分组换入空白对照血清、5倍青光安血清、以及5倍青光安血清和KC7F2;继续在37 ℃、5% CO2箱中培养24 h;取出孔板，吸去上清液，每孔加入1 mL Hochest染色剂，继续在37 ℃、5% CO2箱中培养30 min;取出孔板，观察是否出现荧光;如果出现荧光，首先吸去上清液，PBS清洗2次，封片。每组拍摄3次。

1.8  四氮唑蓝（tetrazolium blue， NBT）核黄素比色法检测SOD含量

样品6倍稀释后种于6孔板中培养至最佳状态，加入底物、酶，测定孔、测定空白孔加样品20 μL，对照孔、对照空白孔加超纯水20 μL。对照孔、测定孔加酶工作液20 μL;对照空白孔、测定空白孔加酶稀释液20 μL。每孔加底物应用液200 μL，混匀后37 ℃加热20 min，450 nm处酶标仪读数。结果计算公式：SOD抑制率=[（对照孔OD值-对照空白孔OD值）-（测定孔OD值-测定空白孔OD值）]/（对照孔OD值-对照空白孔OD值）×100%;SOD活力（U/mL）=SOD抑制率/50%×反应体系稀释倍数×样本测试前稀释倍数。

1.9  硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）比色法检测MDA含量

MDA试剂盒准备完毕后，配置相关试剂：（1）试剂一：37 ℃加热溶解至透明;（2）试剂二：加170 mL超纯水配制;（3）试剂三：加30 mL超纯水后加热95 ℃充分溶解，再加30 mL冰醋酸，混匀。空白管加无水乙醇20 μL，标准管加10 nmol/mL标准品20 μL，测定管加样品20 μL。每管加试剂一20 μL，混匀。每管加试剂二3 mL，加试剂三1 mL。用针在离心管盖上扎1个小孔，混匀后95 ℃加热40 min，取出后流水冷却，3 500 r/min离心10 min，离心半径20 cm，取上清200 μL加入到酶标板中，532 nm处测各管吸光度值。结果计算公式：MDA含量（nmol/mL）=（测定管OD值-空白管OD值）/（标准管OD值-空白管OD值）×标准品浓度×稀释倍数。

1.10  Western blot检测NF-κB、HIF-1α、BNIP3蛋白的表达

RGC-5细胞长至90%铺满时再消化传代。将细胞以5×104个/mL密度接种于6孔板中，2 mL/孔;按以上分组进行处理，37 ℃、5% CO2箱中继续培养24 h;吸去上清液，PBS清洗1次;吸去PBS，每孔加入100 μL蛋白裂解液;细胞刮刀将细胞刮下后吸进1.5 mL离心管中，-80 ℃保存;从-80 ℃冰箱中取出样本，置于冰上解冻，4 ℃下12 000 r/min离心20 min，离心半径20 cm，取上清。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度;根据浓度测定结果对蛋白浓度进行调整，保证不同组别之间蛋白浓度一致，每孔上样量为30 μg，与适量5×loading buffer混匀，95 ℃、5 min后进行上样，剩余样本于

-80 ℃保存。制备电泳胶、上样电泳、转膜、封闭、孵一抗[用含2% BSA的TBST稀释相应的一抗，NF-κB（1∶2 000）、HIF-1α（1∶500）、BNIP3（1∶2 000）];孵二抗[用封闭液稀释HRP标记二抗（1∶5 000）]、显色曝光、膜洗脱再生，再次进行封闭。内参孵育，加入二抗，曝光。曝光结果使用Image J软件分析灰度值。

1.11  统计学分析

用SPSS 26.0软件进行统计学分析，双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。计量资料用“x±s”表示。先进行正态性及方差齐性检验，若数据呈正态分布，且方差齐，则进行单因素方差分析。若分析结果显示，各组间存在差异，则采用Tukey法进行多组比较。若不满足正态性要求，则采用非参数检验，若分布正态但方差不齐者，则采用单因素方差分析。

2 结果

2.1  含药血清和谷氨酸加入量的确定

含药血清中空白组细胞存活率为100%，2.5倍组为89.05%，5倍组为88.96%，10倍组为74.93%。为确保含药量，选用5倍组作为实验量。细胞培养24 h后，谷氨酸加入量为0 μM时细胞存活率为100%、25 μM时为95.85%、100 μM时为84.87%、200 μM时为64.20%，最终选用200 μM的谷氨酸为加入量。

2.2  各组细胞凋亡情况

与空白组比较，模型组凋亡细胞个数明显增多，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，含药血清组和阻断剂组凋亡细胞个数明显减少，差异均有统计学意义（P<0.01）;与含药血清组比较，阻断剂组凋亡细胞个数减少，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表1、图1。

2.3  各组NF-κB、HIF-1α、BNIP3蛋白表达情况

与空白组比较，模型组NF-κB、HIF-1α、BNIP3蛋白的表达明显增加，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）;与模型组比较，含药血清组及阻断剂组NF-κB、HIF-1α、BNIP3蛋白的表达明显减少，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）;与含药血清组比较，阻断剂组NF-κB、HIF-1α、BNIP3蛋白的表达差异无统计学意义（P>0.05）;但与空白组比较，阻断剂组HIF-1α蛋白的表达量明显增加，而BNIP3蛋白的表达量明显减少，差异有统计学意义（P<0.01）。见表2、图2。

2.4  各组SOD和MDA含量表达情况

与空白组比较，模型组SOD及MDA的含量明显增加，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，含药血清组SOD及MDA的含量明显减少、阻断剂组SOD明显减少，差异均有统计学意义（P<0.01）;与含药血清组比较，阻断剂组SOD含量明显减少，差异有统计学意义（P<0.01），MDA的含量差异无统计学意义（P>0.05）;但与空白组比较，阻断剂组MDA的含量明显增加，差异有统计学意义（P<0.01）。见表3。

3 讨论

青光眼在控制眼压后仍然可引起RGC的凋亡，目前对于视神经的挽救方式较少，神经生长因子的效果并不具有优势[10-11]，而干细胞移植仍处于实验室阶段[12-13]。中医药因其具有庞大的药物组分库，具备从中进行创新药物挖掘的潜力，越来越受到学者的重视。彭清华教授所创制的“青光安Ⅱ号方”对RGC的Caspase-3表达有抑制作用，能有效抑制RGC的凋亡[4]，但青光安Ⅱ号方抑制凋亡的具体机制并不清楚。

氧化应激可能与青光眼的视神经损伤有关[14-15]，研究[7]表明活性氧的增加是小胶质细胞在高眼压过程中死亡的主要原因，而抑制氧化应激损伤则可以保护胶质细胞[16]。目前，关于中医药的研究中，细胞黄素、银杏叶提取物对于缺氧损伤的RGC具有保护作用[17-18];枸杞子、丹参、川芎、灯盏细辛等，也具有视神经保护效应[19]。所以本研究从氧化应激的相关细胞因子进行研究，来验证青光安Ⅱ号方对于RGC的保护作用是否是通过调控氧化应激相关因子来实现的。

研究表明，HIF-1α和NF-кB均是氧化应激相关通路中的核心因子，且两者之间还有密切联系：HIF-1α可诱导缺氧细胞中的NF-кB的活化[20];而NF-кB也可与HIF-1α启动子结合，上调缺氧反应中HIF-1α的表达[21]。缺氧反应发生后，细胞内氧自由基的大量生成会引发SOD的上调，其最终产物MDA也会大量生成;同时引发BNIP-3的激活，诱导RGC发生线粒体自噬[22-23]。为了观察青光安Ⅱ号方含药血清是否是通过调控HIF-1α发挥作用，本实验中加入HIF-1α的阻断剂KC7F2，它是一种选择性HIF-1α蛋白翻译抑制剂，可抑制HIF-1α的蛋白合成，进一步抑制BNIP-3和SOD的激活。

中医学认为青光眼的病理机制是气虚血瘀，脉络阻滞，目系失养，玄府闭塞，神水瘀积[24]，中医治疗宜采用益气活血利水的治法，“青光安Ⅱ号方”在此思想指导下应运而生[25]。其组方由黄芪、枸杞子、灯盏细辛、牛膝、川芎、女贞子组成，重用枸杞子、女贞子、牛膝三味，归肝肾经，为滋补肝肾之品，其中以枸杞子、女贞子补肝肾明目为君，另加黄芪补气健脾，四药补益正气取其“正气存内，邪不可干”之意，扶助正气以驱邪外出。故本方以补为主，侧重补肝肾之阴，同时在补益基础上，用牛膝及灯盏细辛活血。黄芪利水，川芎行气，一使气行则血行、气行亦水行，二使全方补而不滞。全方补通兼施，使目窍通畅、气血调和，则诸症俱解。

本次研究中，我们使用谷氨酸诱导RGC-5细胞损伤，模拟青光眼所造成的RGC凋亡[5，26-27]。本次研究结果中，模型组的NF-κB、HIF-1α均出现高表达，与空白组、含药血清组和阻断剂组比较，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），說明当RGC-5细胞损伤出现时，会激活其中NF-κB表达，进一步激活HIF-1α表达，两者可能形成正反馈的调节。SOD、MDA在模型组中表达升高（P<0.01），说明在视神经损伤后，细胞内活性氧增加，引发了SOD上调以及代谢产生MDA的集聚;另外，BNIP-3在模型组中高表达（P<0.01），说明在激活HIF-1α后，引发了BNIP-3途径的线粒体自噬反应，有可能进而形成细胞凋亡。Hoechst法检测到模型组细胞凋亡数量明显多于其他各组（P<0.01），也验证了这一点，且与前期研究的结果一致[4]。而与模型组相比，含药血清组与阻断剂组在谷氨酸致损后，其NF-κB表达均得到了一定的抑制，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;同时此两组的HIF-1α表达也受到明显抑制（P<0.01）;而含药血清组与阻断剂组之间并无明显差异（P>0.05），表明含药血清对RGC-5细胞产生了 组的BNIP-3蛋白表达和SOD含量均明显受到抑制，表明含药血清在抑制NF-κB和HIF-1α蛋白表达的基础上，进一步抑制了BNIP-3和SOD的表达，前者可以减弱RGC-5细胞的线粒体自噬，对抑制RGC的凋亡有正向作用;而后者将导致MDA的减少，与本次实验的结果吻合，最终形成了对细胞凋亡的抑制作用，表现为含药血清组与阻断剂组的细胞凋亡数量明显减少（P<0.01）。

综上所述，青光安Ⅱ号方含药血清对谷氨酸诱导损伤的RGC-5细胞中NF-кB具有抑制作用，进而抑制了HIF-1α通路的激活，减弱了由于氧化应激所致的细胞凋亡。

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