阿胶酶解物HPLC 指纹图谱建立

付英杰李新健贾玉民 陈 智 任 强 于定荣* 陈 娅

（1.济宁医学院药学院，山东 日照276826； 2.中国中医科学院中药研究所，北京100700； 3.东阿阿胶股份有限公司，国家胶类中药工程技术研究中心，山东 东阿252201； 4.山东中医药大学药学院，山东济南250355）

阿胶Colla Corii Asini始载于《神农本草经》，列为上品［1］。2015年版《中国药典》 规定阿胶是由马科动物驴Equus asinusL.的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶，具有补血滋阴、润燥、止血的功效，多用于治疗眩晕心悸、肌痿无力、心烦不眠、虚风内动、肺燥咳嗽、痨咳咯血、吐血尿血、便血崩漏等［2⁃4］。阿胶含有大量的胶原蛋白、多肽、氨基酸和丰富的微量元素，阿胶的蛋白类含量约60%～80%［5⁃8］，但其有效成分尚不完全明确。阿胶有补血［9］、抗氧化［10］、抗疲劳［11］、耐氧化、耐寒冷、抗休克、增强记忆力、改善皮肤、促骨愈合、抑瘤增效，在一定程度上还能拮抗血液的肝素化，起到止血等作用［12⁃14］。

目前，阿胶的质量评价仍然主要依靠传统的生药学鉴别等方法，其经验依赖性强、准确性较低［15］。2015年版《中国药典》 将阿胶用胰酶酶解，再利用HPLC⁃MS 联用技术对阿胶进行鉴定［2］。方法可靠，但操作过程繁琐，而且进行重复时，偶会出现不同厂家、不同产地原料制作的正品阿胶也会不达标的问题，且作为一般的质量控制方法过于昂贵。本实验以阿胶为基础，采用不同的蛋白酶对不同厂家不同批的阿胶进行酶解，取酶解物为样品，建立HPLC 指纹图谱，并进行相似度、聚类及主成分分析，试图解决目前胶类药材无法突破指纹图谱的问题，以期为阿胶的质量评价提供参考。

1 材料

1.1 仪器 安捷伦1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Gemini NX C18色谱柱（广州菲罗门科学仪器有限公司）；KQ⁃500DB型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；PH⁃3E 酸度计（南京桑力电子设备厂）；CP224C 电子天平（奥豪斯仪器常州有限公司）；SYC⁃15c 超级恒温水浴（南京桑力电子设备厂）。

1.2 试剂 α⁃糜蛋白酶（B604BA0026，1 000 U／mg，上海晶纯实业有限公司）；胰蛋白酶［C119BA0026，≥300 U／mg，生物工程（上海）股份有限公司］。其他试剂均为色谱纯。

1.3 样品 东阿阿胶（S1～S12 批号分别为1305077、1306026、1407017、1408005、1409001、1503022、1503027、1504044、1505001、1508034、1509013、1505039）；福牌阿胶（S13～S22 批号分别为130303、130308、130925（纸 盒）、140386（纸 盒）、1400741、14040708、14100401、14120682、15070462、15070572）；同仁堂阿胶［S23～S32 批号分别为13191482、14191695（大纸盒）、14191794、14191921、14191959、15190704、15191072、15191156、20150139（食 用）、201407012（大铁盒）］；其他品牌华信S33 批号20141102、胶城S34 批号20160401、九芝堂S35 批号20150502。以上未标注产品批均为250 g 普通铁盒装。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备 阿胶加纯水加热配成5%浓度，选用以下2种蛋白酶于40 ℃水浴中酶解4 h，胰蛋白酶（将pH 调至8.0，胰蛋白酶加入量为5 000 U／g 阿胶）、糜蛋白酶（将pH 调至8.0，糜蛋白酶加入量为5 000 U／g 阿胶），酶解后在95 ℃水浴中灭活15 min，冷却，依次使用脱脂棉、定量滤纸和0.45 μm 微孔滤膜进行过滤，即得。

2.2 色谱条件 Gemini NX C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相0.2 mol／L 无水硫酸钠（磷酸调节pH 至2.3，A）⁃乙腈⁃水（B），梯度洗脱（0～5 min，90%～84% B；5～25 min，84%～72%B；25～35 min，72%～60% B；35～40 min，60%～48% B）；体积流量1 mL／min；柱温25 ℃；波长280 nm；进样量20 μL。

2.3 HPLC 指纹图谱建立 取35 批阿胶的胰蛋白酶及糜蛋白酶酶解物，分别在“2.2”项色谱条件下进样，获得HPLC 色谱图，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A 版）叠加色谱图，截取5～35 min 色谱数据，以S1 为参照，时间窗0.2 min，获得对照色谱图ej⁃R［16］。将各色谱图与之对照求得相似度，并以匹配数＝批数的色谱峰作为共有峰。见图1～3。相似度见表1。

图1 不同样品酶解物HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints for enzymatic hydrolysates of different samples

图2 3 厂家胰蛋白酶酶解物生成对照指纹图谱（R）的比较图Fig.2 Comparison of control fingerprints（R） for trypsin hydrolysates of products from three manufacturers

图3 3 厂家糜蛋白酶酶解物生成对照指纹图谱（R）的比较图Fig.3 Comparison of control fingerprints（R） for chymotrypsin hydrolysates of products from three manufacturers

表1 32 批样品相似度Tab.1 Similarities of thirty⁃two batches of samples

2.4 聚类分析 采用SPSS 软件中的聚类分析，首先将峰形一致的峰进行归类，捏合峰的原则为±0.5 min 内的且峰形一致的峰面积并入一个fn，以减少色谱图中的tR误差。然后运用SPSS 19.0 软件对35 批样品进行系统聚类，采用组间联结法，以平方组间距离作为样品相似度的距离公式，绘制树状图，观察样品间是否存在相似性，以寻求其规律性。见图4。

图4 35 批样品聚类树状图Fig.4 Dendrogram for thirty⁃five batches of samples

12 批东阿阿胶除S8、S11＜10 外，其他批东阿阿胶类别距离均＜5，10 批同仁堂阿胶类别距离均＜5，表明不同批东阿阿胶和同仁堂阿胶质量相当稳定，福牌阿胶和其他品牌的阿胶类别距离相对分散，推测其原辅料来源可能较广。同时，东阿阿胶及同仁堂阿胶类别距离非常近，与福牌阿胶形成明显的两大类，因此该法可区分福牌阿胶与另外2 厂。

糜蛋白酶酶解物聚类分析表明，同仁堂阿胶10个批较集中，类别距离均＜5，东阿阿胶可以分为两类，东阿阿胶的S1、S2、S3、S11 类别距离＜5，而其他8 批是另一类，类别距离均＜5，但两类间有较大区别。福牌阿胶中除S19、S22＜10 外，其他批类别距离＜5。其他品牌3 批类别距离＜5。总体来看，各厂家不同批阿胶的糜蛋白酶酶解物类别距离均较近不易区分，与指纹图谱相似度法结论相同，3个厂家的阿胶在糜蛋白酶酶解物色谱图上展现出较高的一致性，因此该法无法区分各厂家产品，而更适于用来做正品阿胶指纹图谱。

2.5 主成分分析 运用SPSS 19.0 统计分析软件对35 批阿胶不同蛋白酶酶解液进行PCA分析，将其投影至低维空间观察其细微差别，将共有峰进行因子分析，再进行标准化处理和运算［17］。表2 显示，按主成分特征值＞1，对方差的累积贡献率＞80%，均需要提取4个主成分，按4个主成分进行分析，根据成分得分系数矩阵得到阿胶胰蛋白酶酶解物各主成分解析表达式分别为A1＝0.121f1－0.164f2－ 0.048f3＋0.058f4＋0.492f5－ 0.183f6＋0.518f7＋0.186f8；

表2 主成分初始特征值和贡献率Tab.2 Initial eigenvalues and contribution rates of principal components

A2＝0.295f1＋0.053f2＋0.199f3＋0.008f4＋0f5＋0.464f6＋0.101f7＋0.515f8；

A3＝－ 0.182f1＋0.675f2－ 0.042f3＋0.544f4－0.073f5＋0.147f6－0.069f7－0.029f8；

A4＝－ 0.588f1＋0.062f2＋0.655f3＋0.105f4－0.092f5＋0.26f6－0.091f7－0.088f8；

阿胶糜蛋白酶酶解物各主成分解析表达式分别为A1＝0.017f1－0.092f2＋0.046f3－0.080f4＋0.070f5＋0.121f6＋0.127f7＋0.125f8＋0.093f9＋0.074f10＋0.049f11－0.001f12＋0.126f13＋0.119f14－0.045f15＋0.099f16＋0.054f17；

A2＝－ 0.070f1－ 0.092f2＋0.121f3＋0.220f4＋0.183f5＋0.091f6－ 0.003f7＋0.017f8－ 0.213f9＋0.259f10－0.293f11－0.032f12－0.008f13－0.037f14＋0.010f15＋0.056f16－0.109f17；

A3＝－ 0.412f1＋0.060f2－ 0.160f3＋0.108f4＋0.014f5＋0.033f6－ 0.031f7＋0.013f8＋0.082f9＋0.040f10－0.034f11－0.048f12－0.007f13＋0.161f14＋0.430f15－0.001f16＋0.336f17；

A4＝－ 0.016f1－ 0.237f2＋0.260f3－ 0.074f4－0.090f5＋0.023f6－ 0.010f7－ 0.001f8＋0.019f9＋0.001f10－0.003f11＋0.679f12＋0.061f13－0.034f14＋0.286f15－0.217f16－0.086f17。根据以上表达式绘制二维散点图，见图5～6。

图5 35 批阿胶胰蛋白酶酶解物PCA 散点图Fig.5 PCA score scatter plot for thirty⁃five batches of E’jiao trypsin enzymatic hydrolysate

同仁堂阿胶的散点相当集中，东阿阿胶除S8、S11 外也比较集中，福牌阿胶及其他品牌阿胶较分散，与指纹图谱及聚类分析结果保持一致；同仁堂阿胶在6个散点图中都很集中，东阿阿胶除S1、S2、S3、S11，福牌阿胶除S19、S22 样品偏离较大外均相对集中，其他3个品牌阿胶样品较为分散。在散点图A1～A2、A2～A4 可区分出东阿阿胶，A1～A3、A3～A4 中可区分出福牌阿胶，A2～A3 可以区分3 厂家阿胶、A1～A4 可以区分3 厂家与其他品牌阿胶。可以看出，东阿阿胶及同仁堂阿胶的胰蛋白酶酶解物PCA分析相当稳定，而糜蛋白酶酶解物PCA分析则可根据具体鉴定需求，灵活选择不同的二维投影方法以区分不同厂家产品。

图6 35 批阿胶糜蛋白酶酶解物PCA 散点图Fig.6 PCA score scatter plot for thirty⁃five batches of E’jiao chymotrypsin enzymatic hydrolysate

3 小结与讨论

3个厂家的阿胶在糜蛋白酶酶解物色谱图上展现出较高的一致性，有17～20个位置匹配数目达到最大，以最大匹配为基准，在5.5、7.1、11.3、12.1、13.0、14.7、15.2、16.0、18.5、28.2、30.3、32.8、34.2 min 共13个位置处出现3 厂家阿胶糜蛋白酶酶解物共有峰；与对照指纹图谱R比较的相似度上，所有样品均＞0.9。表明采用糜蛋白酶酶解物的HPLC 指纹图谱可以较好地作为阿胶质量控制的标准。3个厂家的阿胶在胰蛋白酶酶解物色谱图上则有一定差异，福牌阿胶的色谱峰与另外2 厂有较大区别。3 厂阿胶胰蛋白酶酶解物在5.5、6.2、7.2、9.0、20.1 min 共5个位置处存在共有峰，但福牌阿胶在10.1 min 处的大峰、18.6 min处的峰则有多数样品不能与另外2 厂准确匹配，且5.5 min 处峰信号明显更强，在相似度上，S11 与S16 的相似度小于0.9，观察色谱图是由于S11 在10.1 min 处、S16 在5.5 min 的大峰峰面积明显变小所致，但色谱图其他位置的峰形与其他样品保持一致。

聚类分析与PCA分析结果与其保持一致，胰蛋白酶酶解物聚类分析可作为同仁堂阿胶及东阿阿胶与福牌阿胶之间的鉴别法；而糜蛋白酶酶解物聚类分析则可将所有正品阿胶进行聚类，以期作为区分正伪品的方法。

东阿阿胶及同仁堂阿胶胰蛋白酶酶解物PCA分析相当稳定，可考虑作为厂内批稳定性鉴别方法；糜蛋白酶酶解物PCA分析的不同二维投影可以作为区分不同厂家阿胶的方法。

本实验方法主要解决的是阿胶质控上样品信息不全面、易钻漏洞，以及阿胶指纹图谱困难等问题。由于使用了双酶解物样品进样及指纹图谱的方法（如糜蛋白酶酶解物有多达17个以上的特征峰），与单一指标性成分检测方法比较，掺假难度极大，对打击混伪品有较大的应用价值。