基于UPLC⁃LTQ⁃Orbitrap 技术对肿节风化学成分积累的动态分析

邵 坚李诒光 谢 斌 陈 芳 周立分刘文君*

（1.江中药业股份有限公司，江西 南昌330004； 2.江西中医药大学，江西 南昌330004）

肿节风，又名竹节茶、接骨木，为金栗兰科植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai 的干燥全草，主要分布于浙江、江西、安徽、福建、广东、广西等地［1］。肿节风性平味苦辛，具有清热凉血、活血消斑、祛风通络之功效，传统用于血热发斑发疹、风湿痹痛、跌打损伤［2］；其现代中药制剂多用于治疗各种炎症，如咽喉炎、扁桃体炎、牙龈炎。肿节风中化学成分主要为香豆素、有机酸、黄酮、倍半萜等，且均有抗炎活性［3⁃7］；其中，黄酮还具有抑制血小板凋亡、促进白血病K562细胞凋亡和巨核细胞分化成熟等药理作用［8⁃10］。

中药质量的优劣取决于所含的有效成分群，后者随着生长期的变化往往存在一定的差异［11］。本研究利用UPLC⁃LTQ⁃Orbitrap 对相同地理环境不同生长期肿节风的化学成分进行快速表征，进一步采用组分技术分析不同生长期肿节风的化学成分变化，以期为不同生长期肿节风中化学成分积累动态规律提供参考，也为肿节风药材质量标准研究提供理论依据。

1 材料

ORBITRAP ELITE 质谱仪、Dionex UitiMate 3000（美国Thermo Fisher 公司）；MSA224S 电子天平（德国Sartorius 公司）；KQ1000KDE型数控超声波清洗器（40 kHz，昆山市仪器超声有限公司）。

甲醇、乙腈均为色谱纯级（德国Merck 公司）；甲酸（质谱级，美国Thermo Fisher 公司）；超纯水（美国Millipore 公司）。

不同生长期肿节风样品于江西中医药大学神农园采集，分别为3年生、5年生、8年生，经江西中医药大学朱玉野副教授鉴定为金栗兰科植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai，不同生长期样品各4 份，除去杂质，晒干，备用。

2 方法

2.1 样品制备 参考文献［12］，取本品粉末（过3号筛）0.10 g，精密称定，精密加入水5 mL，60 ℃水浴超声（250 W，40 kHz）处理30 min，放冷至室温，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，续滤液备用；每份样品平行制备2 次。QC（quality control）样本由各待测样品取等量混合而成。QC 样本代表平均样本，每5 针样品进一次QC 样，用于数据的校正。

2.2 色谱条件和质谱条件

2.2.1 色谱条件 Waters CORTECS C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；流动相乙腈（A）⁃0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～1 min，5% A；1～18 min，5%～26%A；18～26 min，26%～100%A）；体积流量0.3 mL／min；柱温40 ℃；进样量2 μL。

2.2.2 质谱条件 FT Orbitrap 检测器，分辨率设为30 000，扫描范围设为m／z100～800；ESI 离子源，喷雾电压4.0 kV，管状透镜电压110 V；毛细管温度350 ℃；鞘气体积流量30 psi（1 psi ＝6.895 kPa）；辅助气体积流量10 psi；二级质谱采用IDA 扫描（丰度最高的3个峰进行CID 碎片扫描）。

2.3 数据处理 通过高分辨质荷比、同位素丰度、Massbank 数据库结合化合物本身裂解规律进行肿节风化学成分鉴定；进一步将采集的质谱数据导入Thermo sieve 软件进行去噪、峰对齐、峰识别等数据预处理，获取数据矩阵；并将矩阵数据导入SIMCA⁃P 14.1（Umetrics，umeå，Sweden）软件，将数据归一化、标准化处理，进行正交偏最小二乘⁃判别分析（OPLS⁃DA）及化学成分关联性分析。

3 结果

3.1 化学成分指认 对比3年、5年、8年生长期的肿节风总离子图，可知不同生长期肿节风的化学成分质谱信息基本保持一致，但响应强度有所差异，见图1。

图1 不同生长年期肿节风总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms for S.glabra of different growth periods

根据QC 样品中化学成分的高分辨质谱信息、保留时间、二级裂解碎片离子，结合文献报道对肿节风的主要成分进行指认，推断鉴定出有机酸、黄酮、香豆素、倍半萜等成分，共31个化合物，见表1。

表1 肿节风化学成分鉴定结果Tab.1 Results for identification of S.glabra constituents

3.2 主成分分析 将处理的数据矩阵导入SIMCA⁃P 进行主成分分析，共得到3个主成分，累积R2X＝0.929，Q2＝0.906。见图2，可知，3年生、5年生、8年生样品均处于在置信区间内，不同生长期样品完全分开，可以明显区分。

图2 不同生长期样品主成分分析图Fig.2 Principal component analysis plot for samples of different growth stages

3.3 OPLS⁃DA分析 参考文献［13］，为了进一步揭示不同生长期肿节风内在化学成分的差异性，采用OPLS⁃DA 筛选。结果见图3，可知，3年生肿节风样品主要分布在置信区间的左侧，5年生肿节风样品主要分布在置信区间的右侧，可以明显区分开；模型中3个参数的数值均大于0.5，OPLS⁃DA 模型可解释能力好；进一步对OPLS⁃DA 模型进行置换检验，结果见图4，随着置换保留度逐渐降低，置换的Y变量比例增大，随机模型的R2和Q2均逐渐下降，表明原模型不存在过拟合现象，模型稳健性较好。结果见图5，5年生肿节风样品主要分布在置信区间的左侧，8年生肿节风样品主要分布在置信区间的右侧，可以明显区分开；模型中，3个参数的数值均大于0.5，OPLS⁃DA 模型可解 释能力好；进一步对OPLS⁃DA 模型进行置换检验，结果见图6，随着置换保留度逐渐降低，置换的Y变量比例增大，随机模型的R2和Q2均逐渐下降，表明原模型不存在过拟合现象，模型稳健性较好。

图3 3年生与5年生肿节风OPLS⁃DA 得分图Fig.3 OPLS⁃DA score for 3⁃year⁃old and 5⁃year⁃old S.glabra

图4 置换检验（1）Fig.4 Permutation test（1）

图5 5年生与8年生肿节风OPLS⁃DA 得分图Fig.5 OPLS⁃DA score for 5⁃year⁃old and 8⁃year⁃old S.glabra

图6 置换检验（2）Fig.6 Permutation test（2）

通过OPLS⁃DA 模型中的VIP＞1.5、P＜0.01 筛选不同生长期肿节风的差异成分。表2 显示，筛选出3年生肿节风、5年生肿节风中14种差异成分，分别为绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、新落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、迷迭香酸、咖啡酸、柚皮素⁃6⁃C⁃β⁃D⁃吡喃葡萄糖苷、柚皮素⁃8⁃C⁃β⁃D⁃吡喃葡萄糖苷、槲皮素⁃3⁃O⁃β⁃D葡萄糖醛酸、山柰酚⁃3⁃O⁃β⁃D⁃吡喃葡萄糖醛酸苷、草珊瑚酚苷A；表3 显示，筛选出5年生肿节风与8年生肿节风14种差异成分，分别为新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、6，7，8⁃三羟基香豆素⁃7⁃O⁃α⁃吡喃鼠李糖苷、柚皮素⁃6⁃C⁃β⁃D⁃吡喃葡萄糖苷、柚皮素⁃8⁃C⁃β⁃D⁃吡喃葡萄糖苷、新落新妇苷、槲皮素⁃3⁃O⁃β⁃D葡萄糖醛酸、落新妇苷、新异落新妇苷、山柰酚⁃3⁃O⁃β⁃D⁃吡喃葡萄糖醛酸苷、异落新妇苷、迷迭香酸；不同生长期的肿节风差异成分基本一致，但相对含量差异较大。

表2 3年生与5年生肿节风中差异成分Tab.2 Composition differences in 3⁃year⁃old and 5⁃year⁃old S.glabra

表3 5年生与8年生肿节风中差异成分Tab.3 Composition differences in 5⁃year⁃old and 8⁃year⁃old S.glabra

3.4 差异成分相对含量变化趋势分析 对不同生长期肿节风的化学成分相对含量动态变化分析，有12种共有差异化学成分存在显著性差异，结果见图7，化学成分随生长期呈显不同的变化趋势，绿原酸、隐绿原酸、新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、迷迭香酸相对含量随年限增加而下降；而咖啡酸、柚皮素⁃6⁃C⁃β⁃D⁃吡喃葡萄糖苷、柚皮素⁃8⁃C⁃β⁃D⁃吡喃葡萄糖苷、槲皮素⁃3⁃O⁃β⁃D⁃葡萄糖醛酸、山柰酚⁃3⁃O⁃β⁃D⁃吡喃葡萄糖醛酸苷相对含量先上升而后下降。

图7 不同生长期肿节风差异成分变化规律Fig.7 Variation rule of differential compositions in S.Glabra at different growth stages

3.5 差异成分相关性分析图8 显示，红色表示正相关，蓝色表示负相关，颜色越深相关性越大，反之越小。不同生长期的肿节风含量差异成分总体关联性较强；隐绿原酸、新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷等成分聚为一类，呈强正相关；绿原酸和迷迭香酸等成分聚为一类，呈强正相关；4⁃柚皮素⁃6⁃C⁃β⁃D⁃吡喃葡萄糖苷，5⁃柚皮素⁃8⁃C⁃β⁃D⁃吡喃葡萄糖苷等成分聚为一类，呈强正相关；咖啡酸、山柰酚⁃3⁃O⁃β⁃D⁃吡喃葡萄糖醛酸苷等成分聚为一类，呈强正相关。

图8 肿节风中化学成分关联性分析Fig.8 Correlation analysis of chemical constituents in S.glabra

4 讨论

该研究对肿节风化学成分进行结构表征，解析化合物的裂解规律共鉴定出31种化学成分，利用代谢组学技术实现不同生长期肿节风化学成分的整体评价。不同生长期肿节风的化学成分差异明显，通过OPLS⁃DA分析筛选出共有14种差异成分，且均为黄酮和有机酸，显示生长期对肿节风中的黄酮和有机酸成分富集影响较大。多数有机酸相对含量随生长年限下降显著，而咖啡酸相对含量先升后降，可能与咖啡酸、绿原酸、隐绿原酸、迷迭香酸的前体成分有关。黄酮相对含量则随生长年限呈现不同的变化趋势，其中酚苷（柚皮素⁃6⁃C⁃β⁃D⁃吡喃葡萄糖苷、柚皮素⁃8⁃C⁃β⁃D⁃吡喃葡萄糖苷）和黄酮苷酸（槲皮素⁃3⁃O⁃β⁃D⁃葡萄糖醛酸、山柰酚⁃3⁃O⁃β⁃D⁃吡喃葡萄糖醛酸苷）相对含量先升后降，二氢黄酮醇苷（新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷）相对含量则逐步下降。相关性分析表明，黄酮、有机酸均表现出结构相似成分呈强正相关，可能与具有相似的生物合成途径有关。本研究借助LTQ⁃Orbitrap 技术对不同生长期肿节风的化学成分进行动态分析，以期为深入研究生长期对肿节风物质基础影响提供依据，同时也为肿节风质量评价和质量控制提供参考。