白术-苍术药对干预溃疡性结肠炎作用机制的网络药理学研究

戴明明 廖 丹 程伟玲 王春鹏 林才志

1.广西中医药大学研究生院，广西南宁 530000；2.广西中医药大学基础医学院，广西南宁 530000；3.广西中医药大学第一附属医院脾胃肝病科，广西南宁 530000

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种主要以结肠或直肠黏膜连续性、弥漫性的炎症改变为特征的慢性非特异性肠道炎症性疾病[1]，主要的临床症状为腹泻、大便伴有黏液或脓血、腹痛等。病情往往反复迁延，治疗后容易复发，难以完全治愈，并存在一定的癌变风险[2]。UC 发病机制尚未完全明确，目前研究认为主要与遗传易感性、自身免疫、外在环境的刺激及肠道黏膜屏障损伤有较大关联[3]。因此，治疗方法以控制炎症、改善临床症状、减少复发为主[4]，药物选择上主要选择使用水杨酸类、糖皮质激素类、免疫抑制剂类药物[5-6]，但仍缺乏能够彻底治愈UC 的方法，且长时间药物治疗带来的不良反应一直困扰着医患双方[7]。

中医药治疗UC 是不可忽视的一种手段，UC 属中医“痢疾”“泄泻”等范畴。白术、苍术为中医治疗泻痢之要药，二者常作为药对配伍使用。现代药理学研究表明，二者的主要成分具有保护肠黏膜、抑制炎症、增强免疫力等药理作用，其水提物能纠正UC 大鼠模型的免疫紊乱，机制可能与其调节炎症因子白细胞介素（interleukin，IL）-2、IL-17 的作用有关[8-10]。但目前UC 的临床研究仍然多针对于近期疗效，机制研究相对较少[11]。本研究基于网络药理学探讨白术-苍术干预UC 的作用机制，为后续进一步研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 白术-苍术药对主要化学成分研究

使用中药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）与中药分子机制的生物信息学分析工具（bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，Batman-TCM）收集白术-苍术的主要化学成分，并使用PubChem 数据库来核对这些化合物的名称与分子结构。设置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%[12]及类药性（drug likeness，DL）≥0.18 作为筛选的条件来筛选这些化合物。

1.2 苍术-白术药对的靶点预测和UC 靶点及苍术-白术药对治病靶点研究

通过Batman-TCM 分析平台，检索白术-苍术的主要化学成分可能作用靶点，靶点获取设置条件Prediction Score cutoff＞20，利用Uniprot 数据库校正靶点名称。以“ulcerative colitis”为关键词在人类基因数据库GeneCards 检索并下载有关的基因。使用“Venny”将苍术-白术药对靶点与UC 作用靶点取交集。

1.3 药物-活性成分-靶点-疾病网络构建

使用Cytoscape 3.2.1 将上述的预测和筛选结果，构建“药物-活性成分-靶点-疾病”网络。

1.4 白术-苍术药对治病靶点蛋白质-蛋白质相互作用（proteinprotein ineraction，PPI）网络数据

通过String 数据库分别构建白术-苍术药对治病靶点PPI 网络图，并绘制PPI 网络中蛋白的条形图。

1.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析

运用R 语言软件对“1.3”中的靶点蛋白进行GO功能富集分析与KEGG 通路富集分析。从富集分析来阐释白术-苍术药对生物学角度的科学内涵。

2 结果

2.1 白术-苍术药对主要成分及靶点

利用TCMSP 和Batman-TCM 收集白术-苍术的主要化学成分，经筛选后共获取16 个有效活性成分，其中白术7 个、苍术9 个。见表1。

表1 筛选出的白术-苍术主要成分与靶点

2.2 UC 相关基因

通过GeneCards 数据库共检索出4209 个UC 相关基因，与白术和苍术有效成分对应的靶基因取交集，得到259 个共同基因。见图1。

图1 药物成分靶点与疾病靶点韦恩图

2.3 构建药物-活性成分-靶点-疾病网络

运用Cytoscape 软件来构建网络，见图2，可见白术-苍术药对通过259 种共同有效成分作用于与UC相关的31 个靶点。图中八边形表示白术-苍术共同有效成分，圆形表示药物-UC 共同靶点。

图2 药物-活性成分-靶点-疾病网络图

2.4 构建PPI 网络

把“2.3”中得到的共同靶点导入String 数据库里面，得到PPI 网络互作图，见图3，图中共含有31 个节点与1920 条边。图中的各个节点表示各基因蛋白，节点互相间的连接线代表所相接的2 个蛋白存在相互作用的关系，连接线越粗则代表这种关系越强。依据邻接节点数，选出居于前30 位靶点，见图4，左列是基因名，数字代表着相应基因邻接节点数目，例如，“MAPK1”邻接节点的数目为41。每个基因邻接的节点数目越多，则意味着其成为核心基因的概率就越大。分析出核心基因主要有E1A 结合蛋白P300（EP300）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activation protein kinase 1，MAPK1）等。

图3 白术-苍术药对治病靶点蛋白质-蛋白质相互作用网络图

图4 筛选出的前30 位核心基因

2.5 关键靶基因GO 功能与KEGG 通路富集分析

利用R 语言软件进行GO 功能和KEGG 通路富集分析后，获得GO 条目1038 个，其中生物过程有829 个，细胞组分有59 个，分子功能有150 个。分别选取前20 位，富集情况见图5～7，主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录、调控DNA 模板转录、细胞增殖与凋亡的调节、细胞外信号调节激酶、细胞内质网膜、炎症反应、特异序列DNA 绑定、蛋白激酶结合、转录共激活因子活性等。KEGG 通路富集中（P ＜0.05）有122 条，选取前18 条通路，富集情况见图8。可见主要有PI3K/Akt 信号通路、缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）信号通路、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路、人类嗜T 细胞病毒1 型（human T-cell lymphotropic virus-1，HTLV-1）、TNF 信号通路、MAPK 信号通路等。

图5 GO（生物过程）富集气泡图

图6 GO（细胞组分）富集气泡图

图7 GO（分子功能）富集气泡图

图8 KEGG 富集气泡图

3 讨论

UC 属于慢性非特异性炎症性肠病，相关炎症信号通路在特定条件刺激下被激活，从而引起肠黏膜炎症损伤。本文通过网络药理学分析得出EP300、TNF-α等核心基因在肠黏膜的炎症反应过程中有重要作用，NF-κB、MAPK、PI3K/Akt 等通路属于炎症信号通路，与UC 的发病有密切联系，具体阐述如下：

NF-κB 在UC 发病机制中的作用：研究表明，NF-κB 在调控与黏膜炎症反应相关的基因中起核心作用，在炎症信号刺激下，NF-κB 从细胞膜向细胞核转位，介导相关下游靶基因的释放，调控细胞坏死、凋亡与癌变等。正常情况下，介导NF-κB 通路的激活信号在T 细胞及其他大多数细胞类型中都是短暂的，主要刺激典型NF-κB 通路，但NF-κB 在HTLV-1 转化的T 细胞株和新近分离的T 细胞中均可被激活，导致HTLV-1 可对NF-κB 进行持续性激活[13]，使得结肠黏膜持续性损伤，而阻断叉形头转录因子O 亚型3的表达，可使NF-κB 活性受到抑制，从而让结肠黏膜损伤得到缓解[14-15]。

NF-κB 与MAPK、PI3K/Akt 信号通路在UC 发病机制中的关系：巨噬细胞特异性表达激活了许多炎症反应链，包括Toll 样受体4（Toll-like receptor，TLR4）、PI3K/Akt 及其下游NF-κB 和MAPK 信号通路等。这些通路在调节UC 患者细胞因子释放和参与UC 肠道炎症和免疫反应中起着核心作用[16]。PI3K/Akt 信号通路在肠道通过大量的细胞因子介导异常炎症反应，其信号活化后，首要的功能就是激活NF-κB 并参与TNF-α、IL-1 等促炎性细胞因子释放，诱导UC 发病[17-18]，而阻断PI3K/Akt 信号通路可以缓解结肠黏膜的损伤[19-20]。在炎症反应过程中，巨噬细胞中MAPK 的磷酸化对NF-κB 的激活和随后促炎症介质的释放至关重要[21]。阻断TLR4 及其下游的NF-κB/MAPK 通路，可降低TLR4、NF-κB、MAPK 信号相关蛋白的表达，同时下调体内炎症因子的释放，从而减轻UC 的炎症反应[22]。

核心基因EP300、TNF-α 与UC 发病的关联：P300 蛋白是一种多向共激活因子，参与结肠组织细胞的凋亡、分化和增殖，体细胞突变EP300 基因已在多种人类恶性肿瘤中发现，包括结肠癌[23]，而EP300 表达水平与结肠癌淋巴结浸润之间存在一定相关性，组织中肿瘤蛋白TP53 的表达水平也高于正常结肠组织[24]。通过巨噬细胞产生的炎症启动因子TNF-α 可促使UC 的发生与进展[25]，其主要通过对中性粒细胞趋化作用，浸润肠黏膜组织细胞，使其出现炎症损伤[26-27]。研究表明，药物可通过抑制TNF-α 的表达水平，并上调相关抗炎因子的表达，修复结肠组织，促进溃疡的愈合，且与IL-22 联合干预UC 的治疗，具有一定靶向治疗的意义[28]。

目前为止，UC 的发病原因与机制研究仍是一个瓶颈，一般认为其主要与环境、感染、遗传及免疫因素相关性较大[29]。本研究采用网络药理学的方法，对于白术-苍术药对通过多成分、多靶点、多通路来干预UC 的作用机制进行了阐释，为下一步实验性的药理研究提供了一定线索，拓展了思路。然而目前对UC 的认知仍处在不断完善之中，其次，网络药理学也具有一定自身局限性，因此可能存在一定程度的偏倚风险，仍需要后续的实验性研究进一步佐证。