土壤生物熏蒸对蔬菜根结线虫及土壤线虫群落的影响

金娜 王学艳 刘倩 彭德良 彭焕 简恒

（1. 北京农业职业学院园艺系，北京 102442；2. 北京市朝阳区社会保险基金管理中心，北京 100020；3. 中国农业大学植物保护学院，北京 100083；4. 中国农业科学院植物保护研究所，北京 100083）

根结线虫是威胁农业生产的重要病原物，其寄主范围广泛，造成经济损失极大，被认为是世界上最具破坏性的植物病原物之一。而目前许多化学杀线剂因其对生态环境的破坏已被禁用，因此符合现代农业无公害、可持续理念的生物防治日益受到重视［1］。生物防治作为一种对环境友好的防治措施，可为根结线虫防治提供新方法［2］。红灰链霉菌（Streptomyces rubrogriseus）HDZ-9-47可寄生南方根结线虫的卵，抑制卵孵化；又可以产生具有杀线虫活性的代谢产物，杀死二龄幼虫；在温室及田间试验中对南方根结线虫的防效可达50%以上，是一种很有潜力的防治根结线虫的生防因子，具有广阔的开发前景［3］。生物熏蒸是利用植物分解过程中释放的活性物质抑制或杀死土壤有害生物的方法［4-5］。王纪磊等［6］研究发现花椒籽熏蒸土壤后番茄根结线虫的根结指数和根结线虫数较对照分别下降73. 6%和85. 4%，防治效果优于阿维菌素。利用甘蓝、花椰菜等植物材料进行土壤生物熏蒸，对真菌、细菌和线虫等植物病害也具有一定的抑制作用［4］。本文以甘蓝作为生物熏蒸材料处理番茄连作土，探究土壤生物熏蒸及土壤生物熏蒸与生防菌HDZ-9-47发酵液联合施用对蔬菜根结线虫的防治效果及对番茄植株生长、产量的影响，明确土壤生物熏蒸对番茄根系线虫群落的影响，以期为利用生物熏蒸绿色防控蔬菜根结线虫提供理论依据，为设施蔬菜生产安全和蔬菜产品质量安全提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植株 选用对根结线虫敏感的番茄（Lycopersiconesculentum）东圣1号品种，种子播种于育苗盘中，以1∶1∶1的蛭石、草炭土和沙子作为基质，精心管理，待小苗长至3-4叶期备用。

1.1.2 供试化学农药 噻唑膦（日本石原产业株式会杜）颗粒剂，商品名福气多，有效成分10%。

1.1.3 熏蒸材料 甘蓝（Brassica oleraceaL.）。在熏蒸前将甘蓝切成大小约5 cm×5 cm的碎片。

1.1.4 生防菌红灰链霉菌（Streptomyces rubrogriseus）HDZ-9-47菌株从感染植物根部的根结线虫卵和雌虫中分离得到，由中国科学院微生物所真菌系统学及生物学研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 生防菌剂制备 将菌株接种于高氏培养基平板，培养7 d后，在超净工作台中将培养基切割成小块，转移入装有25 mL无菌水和一小块无菌脱脂棉的50 mL离心管中，将离心管置于微型涡旋混合仪上充分振荡，使得大部分孢子洗脱，用灭菌的移液器抵住脱脂棉吸出孢子，并用无菌水调配成1012/mL的孢子悬浮液。以此接入基础培养基（玉米粉12.75 g/L，豆粕12.25 g/L，蛋白胨 7.25 g/L，硫酸镁2.2 g/L，硝酸铵 1 g/L，碳酸钙1 g/L，磷酸氢二钾 1 g/L，硫酸锰0.338 g/L，pH 7.2）中28℃、160 r/min连续培养5 d［3］。

1.2.2 试验设计及处理方法 分别于2017年3月1日-7月12日春茬、8月1日-12月31日秋茬在北京市通州区大运河蔬菜配送中心温室大棚分别评估土壤生物熏蒸对蔬菜根结线虫的田间防效及对土壤线虫群落的影响。该地区在试验前种植番茄和黄瓜，南方根结线虫发生较重。试验处理如下：

（1）土壤熏蒸处理：先将甘蓝切碎，以3.5 kg/m2的用量混入土壤，添加0.1 kg/m2的碳酸氢铵，翻耕，浇足水分后覆盖地膜。20 d后揭膜，再次翻耕，充分晾晒散湿后定植。

（2）按照处理（1）的方法进行生物熏蒸，熏蒸20 d后，在定植时以穴施的方法每株苗接入200 mL红灰链霉菌HDZ-9-47发酵液。

（3）噻唑膦按2 kg/667 m2剂量拌土撒施。

（4）空白对照：不做任何处理，表示为：CK。

每处理4个小区，每小区10 m2，各小区按照完全随机排列，每次调查每处理取样9-12株番茄。

1.2.3 病害调查 春茬分别在定植前、定植60 d、90 d取土样，深度为0-20 cm，每处理每行取3个点，调查根结级数和防治效果。根结指数调查采用0-10级分法［7］。定植90 d时调查番茄茎粗及产量。

病情指数=∑（病级株数×该级代表数值）/ （调查总株数×发病最高一级的代表数值）×100

防效%=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%

1.2.4 土壤线虫的分离和固定 秋茬分别在定植前、定植60 d、90 d、120 d取土样，深度为0-20 cm，每处理每行取3个点，采用悬浮离心法分离土壤中的线虫，过程如下：

100 g土样中加入100 mL水充分搅拌，静置30 s后将上层浑浊液倒入离心管。重复上述步骤，浑浊液倒入离心管。将悬浊液2 000 r/min 离心5 min，上清液倒入干净烧杯。在沉淀中加入100 mL 20%的盐溶液，搅拌混匀1 500 r/min 离心1 min，上清液倒入干净烧杯，沉淀中加入50 mL 20%的盐溶液，搅拌混匀1 500 r/min 离心1 min，上清液倒入干净烧杯。将3份上清液过500目筛网，用少量清水将筛面上线虫洗入50 mL量杯中［3］。

将上述分离的线虫，65℃水浴2 min杀死，加入TAF（福尔马林（40%甲醛）70 mL，三乙醇胺20 mL，蒸馏水 910 mL）固定液至2 mL，固定24 h。将TAF固定的线虫样本与30%甘油1∶1混匀，60℃水浴3 h。

1.2.5 土壤线虫的鉴定 于400倍显微镜下，依据Goodey分类系统，《植物线虫志》［8］、《植物线虫学》［9］、《中国土壤动物检索图鉴》［10］鉴定到属，再将属按营养类群归类，即食细菌类线虫、食真菌类线虫、植物寄生类线虫和捕食-杂食类线虫。

1.2.6 线虫群落指数计算 采用自由生活线虫成熟度指数MI（maturity index）和植物寄生线虫成熟度指数PPI（plant parasite index）表达各生境土壤线虫群落功能结构特征。计算公式如下［11］：

式中，CPi为非植物寄生性（植物寄生性）线虫第i类群colonizer-persister值；n为非植物寄生性（植物寄生性）土壤线虫类群数；Pi为土壤线虫群落非植物寄生性（植物寄生性）土壤线虫第i类群的个体数占群落总个体数的比例。

采用国内外学者普遍运用的Shannon-Wiener指数与Pielou均匀度指数和Margalef丰富度指数相结合研究土壤线虫的群落多样性。公式如下：

式中，Pi为土壤线虫群落第i类群个体数占总个体数的比例；S为土壤线虫群落线虫类群数，N为土壤线虫群落全部类群的个体总数［11］。

1.2.7 数据分析 利用SPSS13.0软件，采用Duncan新复极差法分析各处理差异显著性。

2 结果

2.1 土壤生物熏蒸对番茄根结线虫的防治效果

土壤生物熏蒸可以显著降低番茄根部的根结级数（P＜ 0.05，表1，图1）。在定植60 d和90 d时，土壤生物熏蒸后对蔬菜根结线虫的防效分别达58.6%和45.8%，与化学农药对照噻唑膦的防效无显著差异（P ＞0.05）。生物熏蒸后再施用红灰链霉菌HDZ-9-47发酵液处理在定植60 d和90 d时对根结线虫的防治效果分别达65.5%和55.0%，高于单独生物熏蒸。结果表明土壤生物熏蒸能够有效防治蔬菜根结线虫病的发生，生物熏蒸与红灰链霉菌HDZ-9-47发酵液联合施用的效果更佳。

图1 田间小区各处理番茄根部90 d发病状况 Fig. 1 Disease situation for the tomato roots at 90 d under different treatments in the tomato field

表1 田间小区各处理的根结级数及防效Table 1 Root-knot series and control efficacy under different treatments in the tomato field

2.2 土壤生物熏蒸对番茄产量及茎粗的影响

不同处理的番茄产量结果见图2。对照的番茄产量为2.3 kg/株，土壤生物熏蒸及生物熏蒸后再施用HDZ-9-47发酵液处理对番茄都有一定的增产作用，土壤生物熏蒸较对照增产0.4 kg/株（P＜ 0.05），生物熏蒸和HDZ-9-47发酵液联合施用处理增产0.6 kg/株（P＜ 0.05），噻唑膦增产0.1 kg/ 株。如图2所示，不同处理的茎粗在定植90 d时与对照没有显著性差异。综上所述，生物熏蒸及生物熏蒸后施用HDZ-9-47发酵液处理可以提高番茄产量，但对番茄茎粗无显著性影响。

图2 土壤生物熏蒸对番茄产量及茎粗的影响Fig.2 Effect of biofumigation on tomato yield and stem diameter in the tomato field

2.3 土壤生物熏蒸对线虫各营养类群的影响

为了进一步明确生物熏蒸对土壤线虫群落的影响，在秋季进行了该研究，从各处理土样中共鉴定出6目12科22属的线虫（表2），分别归属于四大营养类群，植物寄生类、食真菌类、食细菌类和杂食/捕食类，其中植物寄生类1目3科6属，都属于垫刃目，非植物寄生有5目9科16属。

表2 田间小区土壤线虫功能类群及cp值Table 2 Functional groups and cp values of soil nematode in the tomato field

将生物熏蒸和CK处理的各营养类群所占土壤线虫数量的比例进行统计，结果表明在定植60和90 d时植物寄生类线虫数量所占比例较大，显著高于其他类群。食真菌类线虫、食细菌类线虫和杂食/捕食类线虫数量所占比例较小。定植30、60和90 d时生物熏蒸处理中的食细菌类和捕食/杂食类线虫数量的比例要高于CK处理，食真菌类线虫和植物寄生类线虫的数量比例要低于CK处理。结果表明生物熏蒸能降低土壤中植物寄生类线虫和食真菌类线虫的数量比例；提高土壤中食细菌类和捕食/杂食类线虫的数量比例（图3）。

图3 不同处理各营养类群在土壤线虫中所占比例Fig. 3 Ratio of every trophic group to soil nematode under different treatments

MI（自由生活线虫成熟度指数）、PPI（植物寄生线虫成熟度指数）、和PPI/MI是指示土壤群落功能类群特征的常用指数。MI指数和PPI指数分别指示土壤自由生活线虫和植物寄生线虫r-选择和k-选择所占的比例，显示了线虫的生活周期、繁殖力和抗干扰能力的强弱，用来评价外界干扰活动对土壤线虫群落的影响［10］。MI指数越低，表示环境系统所受的干扰越大。PPI建立在线虫地理分布、食性类型、土壤类型和演替等因素之上。PPI指数越高表明植物寄生线虫量越大。PPI/MI更能反映农业生态系统丰富度，且在一定条件下，Ml和PPI的值相反。定植前不同处理土壤自由生活线虫成熟度指数（MI）、植物寄生线虫成熟度指数（PPI）和PPI/MI差异不显著（P ＞0.05）。定植60、90和120 d生物熏蒸处理中的MI指数高于对照处理，表明生物熏蒸降低土壤环境所受的干扰。各处理MI均在定植60 d时达到最小值，表明定植60 d时土壤环境受到的干扰最严重。定植60、90和120 d生物熏蒸处理中PPI和PPI/M低于对照处理，表明生物熏蒸处理降低了土壤中植物寄生线虫的数量（图4）。

图4 不同处理线虫功能类群特征Fig.4 Characters of nematode functional groups under different treatments

生物多样性指数是群落生物组成结构的重要指标，反映了群落内物种的多寡和生态系统中食物网的复杂程度，从而反映各生境间的相似性和差异性。一方面，群落内组成的属愈丰富，群落多样性越大；另一方面，群落内个体在属间分配越均匀，群落多样性越大。多样性指数H'指的是土壤中所有线虫及由这些生物与环境相互作用构成的生态系统的多样化程度，它给予稀有种更多的权重，值越大，多样性越高。丰富度指数SR即土壤所含线虫类群的多寡，SR值大，表明土壤中线虫的类群多。均匀度指数J值范围为0-1之间，J值越大，种间个体数分布越均匀［10］。定植30、60、90和120 d时，生物熏蒸处理的多样性指数H'高于对照处理，表明生物熏蒸可增加土壤线虫多样性。多样性指数H'在各处理中有先降低再升高的趋势；在定植60 d时达到最小值，表明各处理在定植60 d时线虫多样性最低。生物熏蒸处理丰富度指数SR低于对照处理，表明生物熏蒸可显著降低土壤线虫类群数量。生物熏蒸处理均匀度指数J高于对照处理，表明生物熏蒸处理种间个体数较CK处理分布均匀（图5）。

图5 不同处理土壤线虫群落结构Fig. 5 Structure of soil nematode community under different treatments

3 讨论

根结线虫是一类全球性分布、寄主范围广泛、对重要经济作物造成巨大损失的重要植物寄生线虫。目前，对根结线虫的防治方法主要包括轮作防病、抗线虫品种的培育、杀线虫药剂、物理防治方法及免疫和抗性砧木的使用。但轮作和使用抗性品种存在一定的局限性，长期使用化学农药带来了一系列副作用，因此需寻找环境友好的替代方法防治蔬菜根结线虫［4］。生物熏蒸作为一种安全有效手段在防治蔬菜根结线虫病中越来越受到重视［3］。本文研究了甘蓝生物熏蒸对蔬菜根结线虫的防治效果。结果显示土壤生物熏蒸可以较好的防治根结线虫对番茄的危害，在定植60和90 d防效分别达58.6%和45.8%。本研究以芸薹属植物甘蓝为生物熏蒸材料，其植物组织中含有大量的硫代葡糖酸脂，该物质在腐烂过程中可被自身产生的植物源酶黑芥子酶水解而形成挥发性和杀生性很强的异硫氰酸脂类物质，从而杀死土壤中的线虫，致使田间初始虫口密度下降。熏蒸后，膜下温度可高达55℃，高温也对线虫等有致死作用［4，13］。李世东等［14］研究发现用甘蓝生物熏蒸处理对土壤中线虫有明显的灭杀作用，对番茄根结线虫的防治效果可达48%。曹素芳［15］比较了球茎甘蓝、甘蓝、大白菜、小白菜、芥兰、油菜和菠菜对南方根结线虫的生物熏蒸效果。结果表明，球茎甘蓝的熏蒸效果最好。红灰链霉菌HDZ-9-47发酵液和生物熏蒸在防治番茄根结线虫具有协同效应，两者联合施用的防效较单独生物熏蒸提高近10%。Jin等［16］研究发现生防菌和生物熏蒸联合施用可以通过调整土壤微生物群落来协同防治根结线虫病，其防治效果高于两者单独施用。

线虫群落是土壤动物中非常有效的指示群体，可用于指示土壤的健康状况。很多学者也开始利用土壤线虫群落来判断指示用药的安全性。段玉玺［17］发现涕灭威可降低大豆田土壤线虫生物多样性；陈立杰等［17］研究表明施用生防颗粒剂不仅可以防治土壤中大豆孢囊线虫和其他植物寄生线虫，而且提高了非植物寄生线虫的数量，改变了土壤生态区系，对土壤生态环境产生了积极影响。梁文举［18］研究发现生防颗粒剂的施用对大豆田土壤线虫生物多样性有促进作用，而乙草胺和呋喃丹致使土壤线虫群落受到扰动，食物网受到胁迫。本文评价了甘蓝生物熏蒸对土壤线虫群落的影响。研究结果显示定植60、90和120 d时甘蓝生物熏蒸处理中的植物寄生类线虫数量所占比例分别为50%、47.06%和62.5%，显著低于对照处理中的83.38%、86.54%和88.11%；定植30、60、90和120 d时甘蓝生物熏蒸处理中的食真菌类线虫数量所占比例分别为8.33%、6%、4%和3%，显著低于对照处理中的12.5%、7%、5.77%和6.29%。定植30、60、90和120 d时甘蓝生物熏蒸处理中的食细菌类线虫数量所占比例分别为26.67%、20%、23.53%和18.75%，显著高于对照处理中的15.63%、7.69%、5.77%和3.5%；定植30、60、90和120 d时甘蓝生物熏蒸处理中的捕食/杂食类线虫数量所占比例分别为31.67%、24%、25.41%和15.75%，显著低于对照处理中的12.5%、1.92%、1.92%和2.1%。结果表明甘蓝生物熏蒸可以降低土壤中植物寄生类线虫和食真菌类线虫的数量比例；提高土壤中食细菌类线虫和捕食/杂食类线虫的数量比例。杂食/捕食类线虫参与土壤有机物的分解和养分循环过程，能够间接的对植物生长产生有益影响。食细菌和食真菌线虫通过取食活动刺激土壤的分解作用和氮素矿化作用，进而提高了植物对土壤养分的利用率。而植物寄生线虫的种群数量增大会对农作物造成危害，但非植物寄生线虫数量增长和空间占位将对植物寄生线虫群体有一定的抑制作用［19］。结果说明甘蓝生物熏蒸对土壤环境产生了积极的影响。此外本研究发现生物熏蒸可以增加土壤线虫群落的MI指数，降低PPI指数和PPI/MI，表明生物熏蒸降低了土壤受到干扰的次数和强度，对植物寄生线虫也有一定的抑制作用，增加土壤生态系统丰富度。由于根结线虫长期处于优势地位，其空间占位对自由生活线虫数量有一定抑制作用，所以空白对照CK处理PPI/MI值较高。而生物熏蒸使得根结线虫密度显著下降，所以PPI/MI值降低，即生物熏蒸减小土壤生态系统所受到的扰动，对环境健康起到了作用。

本研究中多样性指数H'在1左右，丰富度指数SR均低于1，远低于陈瑶对北京地区栽培感病作物的保护地所调查得到的H'平均值1.50和SR平均值2.42［20］。两项指标较小，表明供试温室土壤多样性较低。陈瑶研究不同复种对土壤线虫群落的影响，不同作物对土壤线虫群落产生不同的影响，几种作物复种之后土壤线虫多样性较大。而本研究供试温室连续7季种植相同作物，相同的农艺措施使得土壤线虫种类变少，优势种群趋向一致，且植物寄生线虫的空间占位对非植物寄生线虫数量增长有一定抑制作用，所以温室土壤多样性严重降低。

4 结论

甘蓝熏蒸可以较好的防治蔬菜根结线虫，且对土壤线虫群落安全，与其他措施如生物杀线剂配合在防治蔬菜根结线虫中具有巨大潜力。