大豆孢囊线虫生防菌株Myrothecium verrucaria ZW-2发酵条件优化及活性物质分析

陈倩 张露源 陈伯昌 吴海燕

（广西农业环境与农产品安全重点实验室 广西大学农学院，南宁 530004）

大豆是全球粮食安全的重要作物，每年因大豆病害造成了严重损失，其中大豆孢囊线虫病（SCN，Soybean cyst nematode，Heterodera glycines）是 危 害大豆最严重的病原之一［1-2］，在世界上各大豆产区均有发生，中国、美国、加拿大、巴西、阿根廷、俄罗斯等大豆生产国广泛发生，每年造成大豆减产10%左右［3］，给世界大豆造成的产量损失在900万t以上，在中国，截止到2015年共有23个省（市/自治区）相继发现大豆孢囊线虫［4］，使大豆产量大大降低，影响豆类作物生产安全［5］。

目前，防治植物线虫病害仍以化学防治为主，但随之也带了许多问题，如环境污染、抗药性问题等，许多高毒高残留的化学杀线虫剂如溴甲烷［6-7］、呋喃丹［8］等已被禁用。随着人们环保意识逐步提高，寻求低毒、低残留、对环境友好的生物制剂越来越受到关注，并成为防治植物线虫病害的关注热点。近年，菲律宾、中国、美国、南非、印度、加拿大等国登记注册了以淡紫拟青霉为活性成分的菌剂来防治植物线虫［9］。淡紫拟青霉菌和蓖麻油防治猕猴桃幼苗的根结线虫病，防治效果分别在55%和73.61%以上，防效良好［10］。芽孢杆菌Sneb207可降低大豆孢囊线虫孢囊、幼虫以及卵的数量，还可促进大豆植株的生长［11］；芽胞杆菌BL-21与HNDF2的混合菌液对大豆孢囊线虫孢囊孵化的相对抑制率达到了80.93%，对2龄幼虫（J2）的校正死亡率也达到91.08%［12］。研究报道疣孢漆斑菌的发酵产物二萜化合物实现了商业化［13］，广泛应用于高价值水果、蔬菜和观赏作物，对根结线虫、禾谷类孢囊线虫、短体线虫等十余种线虫有防效［14］；疣孢漆斑菌麦芽提取物液体可有效减少番茄根部根结数以及土壤中根结线虫的数量［15］；然而，我国该方面的研究进展较慢，仅报道菌株X-16可有效控制北方根结线虫群体［16］。本研究在明确疣孢漆斑菌ZW-2菌株发酵液对大豆孢囊线虫有毒杀作用的基础上［17］，通过筛选菌株活性物质产生的最佳发酵温度、转速、装瓶量、pH以及培养基的最佳营养物质，确定其产生杀线虫活性代谢产物的最优培养条件，并且利用代谢组分析ZW-2菌株代谢物质中的活性成分，为开发和应用M. verrucariaZW-2菌株的杀线虫功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 ZW-2菌株学名为Myrothecium verrucaria，GenBank登录号KR708633。保存在中国菌种保藏中心（登记号CCTCC NO：M 2015522）。

1.1.2 供试线虫 供试线虫为大豆孢囊线虫（Heterodera glycines，4号生理小种），收集接种大豆孢囊线虫后35 d后的大豆植株（品种为鲁豆4号）根系上新鲜孢囊，用70%酒精消毒3 min，无菌水冲洗4次，在立体显微镜下，用玻璃棒将300目孵化筛中的孢囊碾碎分解，加少许灭菌水，得到卵悬浮液。将孵化筛置于25℃的智能光照培养箱中避光孵化，收集新鲜的J2用于当天的试验。

1.2 方法

1.2.1 基础发酵液制备 25℃恒温条件下，菌株ZW-2在PDA平板（直径为9 cm）培养5 d后，用直径为6 mm的打孔器在菌落边缘打取菌块，将菌块转接至装有100 mL Czapek培养液（NaNO32.00 g，KCl 0.50 g，FeSO40.01 g，K2HPO41.00 g，MgSO40.50 g，蔗糖30.0 g，H2O 1 000 mL）的250 mL锥形瓶中，置于28℃、160 r/min的恒温摇床培养14 d，发酵液通过0.45 μm滤膜过滤获得发酵滤液。

1.2.2 发酵液杀虫活性检测 在96孔板中，每孔中大豆孢囊线虫J2（24 h内收集的）约50条左右，并加入200 μL菌株ZW-2发酵滤液，以灭菌蒸馏水为对照（由于前期预实验结果表明培养基和灭菌水对大豆孢囊线虫无显著影响［17］，故本研究仅设灭菌水为对照），每个处理设置4个重复，将96孔板置于25℃的恒温培养箱中，每隔6、12、24、48、72 h在显微镜下观察记录线虫的死亡数量，并计算出死亡率。线虫死亡判定标准：线虫僵直，且用毛针刺激后不活动，确定线虫死亡。

死亡率=（死亡J2总数/处理J2总数）×100%

校正死亡率=（处理组死亡率-对照组死亡率）/（1-对照组死亡率）×100%

1.2.3 发酵温度、摇床转速、培养基pH以及装瓶量对发酵液杀虫活性的影响 为了筛选出菌株ZW-2的最佳发酵条件，以发酵温度、发酵转速、培养基pH以及装瓶量作为4个因素，设置发酵温度（A1=26℃、A2=28℃、A3=30℃）、发酵转速（B1=140 r/min、B2=160 r/min、B3=180 r/min）、培养基pH（C1=6、C2=7、C3=8）以及装瓶量（D1=75 mL、D2=100 mL、D3=125 mL）进行4因素3水平的正交设计实验，然后按照1.2.2的方法培养：培养菌株1周（前期试验表明培养菌株1周、2周、3周发酵滤液对大豆孢囊线虫死亡率无显著差异，故选用发酵1周进行试验）后，发酵液稀释5倍［17］，0.45 μm过滤器过滤，通过测定对大豆孢囊的毒杀作用，筛选最优组合后做碳氮源的优化。评价标准：菌株ZW-2发酵滤液处理大豆孢囊线虫72 h的死亡率。

1.2.4 营养条件优化 碳源筛选：用葡萄糖、麦芽糖和可溶性淀粉3种碳源替代基础发酵液培养基（Czapek培养基）中的蔗糖作为碳源，其他成分不变。发酵方法同1.2.1，摇床温度28℃，转速为180 r/min。培养菌株1周后，发酵液稀释5倍，0.45 μm过滤器过滤，通过测定杀线活性试验，方法同1.2.2，灭菌水为对照。进行3次重复试验。

氮源筛选：用氯化铵、牛肉膏和硫酸铵这3种氮源替代基础发酵培养基（Czapek培养基）中的硝酸钠作为氮源，其它成分保持不变。发酵方法同1.2.1，摇床温度28℃，转速为180 r/min。培养菌株1周后，发酵液稀释5倍，0.45 μm过滤器过滤，测定杀线活性方法同1.2.2，灭菌水为对照。进行3次重复试验。筛选出最佳碳源，最后根据单因素试验结果筛选出最佳碳源和氮源。

正交设计实验：根据单因素实验筛选出的最佳碳源A（A1=20 g、A2=25 g、A3=30 g、A4=35 g、A5=40 g）和氮源B（B1=1.0 g、B2=1.5 g、B3=2.0 g、B4=2.5 g、B5=3.0 g）进行2因素5水平的正交设计实验。发酵方法同1.2.1，摇床温度28℃，转速为180 r/min。培养1周后取出，将发酵液稀释5倍，用0.45 μm过滤器过滤后，进行杀线活性测定，方法同1.2.2，以灭菌水为对照。此试验重复3次。

1.2.5 ZW-2菌株发酵液的代谢产物杀线虫活性成分研究 将1.2.1得到的8 L菌株ZW-2液体发酵液滤液过滤后旋蒸浓缩至500 mL，由正丁醇萃取的粗提产物经甲醇凝胶柱层析分离收集得到不同的流分，每隔2 min收集一次洗脱液。洗脱液各极性组分可通过薄层色谱法（TCL）分析检测，经显色的斑点不同指引合并，纯化后筛选杀线虫效果最好的流分进行化合物代谢组学分析。

应用超高效液相-质谱联用仪对大豆孢囊线虫72 h死亡率达到了80%以上的流分加以处理进行代谢物质鉴定。色谱条件为流动相A相为水和0.1%甲酸溶液，流动相B相为甲醇溶液，进样量2 μL，洗脱条件为：0-10.00 min，90.0% A（V∶V，下同），10.0% B；10.00-12 .00 min，5.0%A，95.0%B；12.10-15.00 min，90.0%A，10.0%B。质谱扫描模式为MSECentroid，正、负离子。离子源为ESI。质量扫描范围：100-1 200 Da。毛细血管电压设置为3 Kv，离子源温度设置为100℃，脱溶剂气体温度设置为450℃，气体流速设置为650 L/h，锥孔气体流量设置为50 L/h。

1.2.6 数据统计与分析 用SPSS 19.0进行试验数据的方差分析，根据Duncan’s新复极差法检验P＜ 0.05水平下的差异显著性，用Sigmaplot10.0作图。

根据多元统计分析（PLS-DA）结果得到的变量权重值选择差异变量。通过UNIFI Protal软件分析，ProgenesisQI作图，之后通过代谢物数据库（KEGG、PlantCyc等）确认差异物及其结构式。

2 结果

2.1 菌株ZW-2杀线虫活性发酵液条件优化分析

2.1.1 发酵温度、摇床转速、培养基pH以及装瓶量对发酵液杀虫活性的影响 试验结果表明，对ZW-2菌株发酵液杀线效果影响的重要因素依次为因素B（摇床转速）、因素A（发酵温度）、因素D（装瓶量）和因素C（培养基pH）。并且当摇床转速为180 r/min，发酵温度为28℃，装瓶量为100 mL，培养基pH为8（表1）时，杀线效果最好，为菌株ZW-2发酵液的最佳发酵条件。

表1 不同发酵温度、摇床转速、培养基pH和装瓶量的ZW-2菌株发酵液处理大豆孢囊线虫J2校正死亡率Table 1 Adjusted mortality rate of H. glycines J2 treated with ZW-2 strain fermentation broth under different fermentation temperature，shaking speed，medium pH and bottle volume

2.1.2 菌株ZW-2发酵液碳源和氮源种类杀线虫活性优化 菌株ZW-2在不同成分碳源条件的Czapek培养基中发酵1周5倍稀释滤液处理大豆孢囊线虫SCN毒杀效果显著（P＜0.05），均随时间的增加死亡率逐渐升高，72 h后大豆孢囊线虫的死亡率达到了87.00%以上。72 h菌株ZW-2的发酵液处理大豆孢囊线虫J2后，死亡率最高的处理是以蔗糖以及淀粉作为培养基碳源，死亡率分别为96.29%和93.35%，杀线效果显著高于其他处理及灭菌水对照（P＜ 0.05）（图1）。

图1 菌株ZW-2在不同碳源培养基中发酵1周的5倍稀释发酵液处理大豆孢囊线虫J2校正死亡率Fig.1 Adjusted mortality rate of H. glycines J2 treated with 5-fold diluted fermentation broth of strain ZW-2 in different carbon source medium for 1 week

菌株ZW-2在不同氮源条件的Czapek培养基中发酵1周，培养菌株ZW-2获得的5倍稀释滤液对大豆孢囊线虫J2毒杀效果显著（P＜0.05）（图2），当以硝酸钠、硫酸铵、牛肉膏和蛋白胨作为培养基的氮源时，死亡率随时间的增加而增加。当氮源为氯化铵时，处理72 h发酵滤液对大豆孢囊线虫J2的毒杀效果低于处理48 h，此时存在部分线虫活动能力恢复的现象。当氮源为硝酸钠、牛肉膏和蛋白胨时，72 h发酵滤液对大豆孢囊线虫J2 的毒杀效果最好，死亡率分别为96.29%、88.01%和91.36%，并且与对照组相比，死亡率明显升高，差异效果显著（P ＜0.05）。但由于经济效益的影响，最终选择蔗糖以及硝酸钠作为培养基的最佳碳源以及最佳氮源。

图2 菌株ZW-2在不同氮源培养基中发酵1周的5倍稀释发酵液处理大豆孢囊线虫J2校正死亡率Fig.2 Adjusted mortality rate of H. glycines J2 treated with 5-fold diluted fermentation broth of strain ZW-2 in different nitrogen source medium for 1 week

2.2 菌株ZW-2发酵液代谢产物杀线虫活性成分研究

发酵液旋蒸萃取洗脱后，洗脱液根据TLC检测和紫外分析检测的斑点合并后得到的组分，经检测后对大豆孢囊线虫具有毒杀作用，72 h后线虫死亡率达到了87.65%，与对照组相比，毒杀效果显著。

利用UPLC-Q-TOF对ZW-2菌株发酵液流分以及溶于甲醇的Czapek培养基进行对照检测，对主要的差异性物质通过PCA和PLS-DA法进行多元统计分析，分析组间的差异性以及组内的重复稳定性，再通过数据库进行人工对比，对检测中的可能性的差异性物质进行推测。

由图3可知，对照组和流分分布在不同的区间，两者之间差异显著，分离趋势比较明显，同一处理能够近距离聚焦，能较好地区分流分与对照，这初步说明数据有效可信。我们可以进一步采用PLS-DA法差异性代谢物进行判别检测。由PLS-DA模型的变量重要性投影值（VIP）值的各代谢物积累差异的影响强度以及解释能力，综合显著性检验结果，对潜在的差异性代谢物进行分析，准确的反映标志性代谢物信息。

图3 ZW-2菌株液体发酵液流分正离子（A）和负离子（B）PCA散点图Fig. 3 PCA score plot of positive（A）and negative（B）ions in the fermentation broth of strain ZW-2

由PLS-DA结果及获得的多变量分析模型的变量重要性投影值（VIP）初步筛选出差异代谢物，得到4 393个物质数据矩阵，以碎片正负离子得分以及发酵液活性物质性质以及物质功能，筛选出具有发酵液活性成分的20个物质。

同时通过检测出的正负离子特征经分析在ChemSpider数据库中对比可得，筛选出物质为脂肪族化合物，如脂肪酸脂类、醇与多元醇、醚类、酯类化合物等。标志性差异物质可能是磷酸三（丁氧基乙基）酯，NP-40（乙基苯基聚乙二醇）、六聚乙二醇单十二醚、氟氯菊酯、verrucarin A、roridin A、verruculogen、三月桂胺等（表2）。

表2 标志性差异物中可能发酵液活性物质列表Table 2 List of possible fermentation broth active substances in differences iconic objects

3 讨论

近年来利用微生物的代谢产物来防治病害越来越受到人们的关注，筛选出生长速率快、产孢量高、安全高效的菌株具有重要意义以及应用价值［18］。本试验所选用的疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria），抑菌谱较广［19］，抑菌活性较强［20-21］，可用于防治植物寄生线虫［22］，同时对野葛、马齿苋、长芒苋等杂草具有生物除草活性［23］。因此，疣孢漆斑菌的代谢产物具有重要的应用价值。

代谢产物的产量显著影响了生防菌的生防效用。发酵的温度、转速、pH、装瓶量及培养基的碳源氮源等都影响菌株的生长以及代谢产物的活性［24-25］。人们可通过优化生防菌发酵液培养条件，促进菌体生长以及提高菌株的防效［26］，促进毒杀根结线虫J2活性物质的产生［27］。拮抗根结线虫的微白黄链霉菌Streptomyces albidoflavus以燕麦片为碳源、酵母粉为氮源，培养温度25℃，摇床转速210 r/min，培养4 d，起始pH 7，装液量75 mL时毒杀线虫活性达93.29%，提高了8.93个百分点［28］。微白黄链霉菌 G-1发酵液在8% 麦芽糖、马铃薯 16.5%、pH 6.5、温度 30℃、转速 160 r/min、发酵 5 d的条件下抗真菌活性提高，抗菌物质增加［29］。粉红螺旋聚孢属NF-06固体发酵液培养条件pH为7，含水量40%，接种量5%时，产孢量增加，南方根结线虫数量以及番茄根结数有效降低［30］；芽孢杆菌SMrs在发酵48 h，温度28℃，转速180 r/min，装液量30 mL，初始pH 7.2时，杀线虫活性明显提高［31］。

代谢组学（metabolomics）是对生物代谢物质的分析［32］，可用于疾病诊断药物鉴定、植物代谢以及抗逆响应机制等［33］。本研究通过对M. verrucariaZW-2菌株发酵液进行代谢组分析，在试验中经代谢组分析得到Verrucarin A、Roridin A等20种可能与杀虫杀线虫有关的标志物。羌活体内生菌疣孢漆斑菌的发酵液中分离纯化得到了Verrucarin B、8-acetoxyroridin H、Verrucarin M、Verrucarin J、Roridin D、Verrucarin L acetate、Isororidin E、Oridin E、Roridin H、Roridin A、Roridin E acetate、Isotrichoverrin A、Isotrichoverrin B、Verrucarin A等14种化合物，在1 000 ppm浓度下除Isotrichoverrin A均具有良好的杀虫活性，对绿棉铃虫致死率在70%以上［21］；从土壤分离的漆斑菌Myrotheciumsp. KX136897液体发酵后纯化鉴定出Verrucarins A、Roridin D、Roridin A、Verrucarin J、Roridin A、Verrucarin B等，其 中Roridin D对 大 肠 杆 菌有弱抑菌活性、Roridin A对蜡状芽孢杆菌和鳗弧菌也具有抑菌活性［34］；Nguyen等［15］从疣孢漆斑菌KACC40321菌株的丙酮提取物中分离得到Verrucarin A和Roridin A具有杀南方根结线虫J2的活性；Murakami等［35］从来自土壤的Myrothecium verrucaria中分离得到Roridin L、Roridin M、Verrucarin M；将疣孢漆斑菌IT6菌株接种在菠菜上可产生Verrucarin A and Roridin E［36］；本研究通过代谢组分析发现ZW-2菌株发酵液中有多种与杀虫相关的物质，其中Verruculogen，是一种过氧化物的生物碱［37］；氟氯菊酯（联苯菊酯）是一种拟除虫菊酯类［38］，可防治小麦蚜虫［39］、白蚁［40］等农田害虫；三月桂胺可用作萃取剂负载液膜去除工业废水中的砷［41］。但Verruculogen、氟氯菊酯、三月桂胺等物质是否具有杀线虫功能有待进一步验证。另外，董海龙等［22］从疣孢漆斑菌X-16代谢产物中分离出了 3-异丁基六氢吡咯并［1，2-a］吡嗪-1，4-二酮和乙酸丁酯，对根结线虫J2有较好的毒杀活性。但本研究中未检测到该物质，原因可能是分离提取方法不同。因此，本研究的疣孢漆斑菌ZW-2菌株代谢组中标志性差异物，为深入研发该生防菌株提了供理论依据。

4 结论

在前期研究基础上进一步优化菌株ZW-2发酵液毒杀大豆孢囊线虫活性的培养条件，最优条件为：以Czapek培养基为基础培养基，最佳培养温度为28℃，摇床转速为180 r/min，装瓶量为100 mL，培养基pH为8，以蔗糖和硝酸钠为碳源和氮源。通过代谢组学分析，共筛选出20种差异代谢物，包括酰胺类化合物和脂肪族化合物，这些差异代谢物可能是疣孢漆斑菌具有杀线虫活性的标志物，研究结果可为进一步探索疣孢漆斑菌ZW-2菌株发酵生产以及精深加工提供参考依据。