植物寄生线虫对化感信号的识别及机制

李春杰 王从丽

（中国科学院东北地理与农业生态研究所 中国科学院大豆分子设计育种重点实验室，哈尔滨 150081）

植物寄生线虫病是导致农作物减产的重要病害之一，每年由于线虫危害导致的损失超过1 500亿美元［1］。植物寄生线虫的二龄幼虫在土壤中具有趋化性，通过识别由植物根部或者根际微生物释放的化学物质定位寄主，然后侵染寄主。线虫这种随着化学信号物质浓度梯度而移动的现象叫做趋化性，趋化性长期以来被认为是线虫定位寄主植物的主要原因。线虫主要是利用其头部或者尾部感应器官-化感器感应由根或根围微生物产生的水溶性或气体引诱剂，被吸引后移动到植物的根部，例如温度、氧气、二氧化碳、酸、碱、盐、氨基酸等；同时也可感应不利环境所产生排斥、躲避或者逃避等一系列的应激行为［2-9］。线虫到达寄主前是非取食阶段，需要在能量消耗殆尽前找到寄主，如果能够使线虫寻找寄主并未侵染寄主前使其能量消耗殆尽，或干扰、消减吸引线虫侵染的信号物质，使线虫失去侵染寄生植物的机会，即线虫到达寄主植物前由于信号物质的干扰而使线虫侵染失败，这样不仅达到事半功倍高效防治线虫的目的，而且由于侵染行为提前被终止，所以种植抗病和感病品种都不受影响，特别是抗病品种资源缺乏时，利用现有的感病品种将是最大的益处，因为一个抗性品种的培育需要多年。因此，鉴定植物寄生线虫预侵染阶段的天然调节化感物质或者相关调控的分子信号物质，对于开发新型杀线虫剂具有重要的理论和应用意义。目前，有关模式线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的化感分子调控机制研究相对比较多，且在线虫中有一定的保守性。但由于植物寄生线虫独特的侵染结构（口针）和寄生特征，使其与模式线虫有一定的差异，进而加大研究困难，致使植物寄生线虫化感方面的分子调控机制报道甚少。因此本文对当前植物寄生线虫对环境信号的识别或趋化性研究进展进行了综述，再以秀丽隐杆线虫的化感机制为基础，针对植物寄生线虫的化感机制研究进展进行了总结和展望。

1 植物寄生线虫趋化性的信号物质

植物寄生线虫依靠化学信号定位寄主的观点是Steiner在1925年提出的，随后这一观点在许多研究中得以证实［10-11］。通过体外趋化实验已报道有很多吸引线虫的引诱剂，例如，简单的无机盐Na+、Mg2+、Cl-和CH3COO-及环磷酸腺苷（cAMP）均能够吸引肾线虫（Rotylenchulus reniformis），而这些离子对爪哇根结线虫（Meloidogyne javanica）却不吸引［11］；萜烯类化学物质及离子能够吸引柑橘线虫（Tylenchulus semipenetrans）［12］；氨基丁酸和谷氨基酸吸引马铃薯金线虫（Globodera rostochiensis）和马铃薯白线虫（G. pallida）［13］。漆永红［14］报道Cl-和NO3-对马铃薯腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）有吸引作用，而SO42-和HPO4-有排斥作用，HCO3-和CO32-对线虫没有影响。CuSO4对甜菜孢囊线虫（Heterodera schachtii）具有很强的吸引［15］。二氧化碳和氧气被认为是长距离吸引线虫到根围的非特异性趋性物质［16］。

根际分离的灰霉菌和半裸镰刀菌对D. destructor具有很强的吸引［17］，根际细菌及其放线菌的代谢产物对南方根结线虫（M. incognita）也具有吸引作用［18-19］，淡紫拟青霉发酵滤液对大豆孢囊线虫（H. glycines）具有趋避作用［20］。王雪等［21］报道感病大豆品种对H. glycines具有强烈的吸引性，而抗病品种对线虫具有排斥性。Zhao等［22］发现，M. incognita被植物根的吸引和排斥存在着寄主特异性。根渗出物中鉴定出对线虫有吸引和排斥的化学物质，如丁正蛟［23］从7种植物中鉴定出1-二十二烯对M. incognita有吸引作用；Xu等［5］从甘薯乳液中分离出的十八烷基香豆酸，对D. destructor有很强的排斥作用。线虫卵孵化也会受到根分泌物的抑制［24］。

植物激素也参与调控线虫的趋化性，激活的乙烯信号途径能够降低根结线虫［25-26］和大豆孢囊线虫［27］对寄主根的吸引，即乙烯信号途径负调控线虫的吸引；然而，激活的乙烯信号途径却提高了对甜菜孢囊线虫的吸引［28］。Sikder和Vestergård［29］详细综述了根特异性或非特异性代谢产物作为线虫幼虫的引诱剂、排斥剂或杀线虫剂、卵孵化刺激剂或抑制剂对植物寄生线虫的影响。性激素作为大豆孢囊线虫的雄虫引诱剂及马铃薯金线虫同种线虫之间的吸引也起着非常重要的作用［30-31］。

Hamada 等［32］提出了一个线虫吸引模型，证实许多化感物质在不同阶段参与了根对线虫的吸引，主要参与3个阶段。首先是种子黏液（mucilage）吸引线虫运动到种子要发芽的根部位置，Tsai等［33］通过分析拟南芥黏液突变体发现根结线虫对拟南芥种子的吸引需要种皮黏液的合成和挤压，提取的黏液单独不能明显的吸引根结线虫，但是种皮的碳水化合物和蛋白质是线虫被吸引所必需的成分；该研究表明根结线虫的趋化物质是在种皮黏液挤压过程中新合成的，但可能高度不稳定；根结线虫这种依赖于黏液的趋化机制能够影响正在萌发的幼苗，但来自于幼苗根部的信号物质是独立于黏液信号物质，而且幼苗根部信号很可能掩盖黏液信号物质。根萌发后，第二组化合物引导线虫运动到侵染位点。Oota等［34］通过筛选合成物质及分离鉴定根部多胺化合物对南方根结线虫的趋化实验，发现在两个末端氨基间拥有3-5个亚甲基的多胺，例如尸胺、腐胺和丙二胺能吸引线虫到达植物合适的侵染位点。到达根部后，第三组化合物如寄主修饰的线虫信息素水平和种类可能控制侵染的水平［35］。例如目前研究的热点——线虫蛔甙（ascarosides）信息素ascr#18是由线虫所分泌的携带亲脂侧链脂肪酸的双脱氧蛔糖基的糖苷，不仅参与线虫之间的化学通讯而产生线虫的积聚，还能被寄主植物修饰转化成短的侧链蛔甙排斥线虫，从而降低线虫的侵染［35-36］。这和前人报道的基本相似，第一组化合物通常是挥发性气体物质，进行长距离吸引线虫到根围，例如CO2、O2、萜烯类化合物、类黄酮、芳香醇等；第二组化合物通常是水溶性物质能够短距离吸引线虫到根尖部位，如酸性pH、碱性pH、盐、激素、氨基酸等；第三组局部线虫之间的化学通讯决定线虫侵染水平（图1）。这些研究表明线虫趋化性和线虫识别、定位和侵染寄主有着密切的关系。

图1 植物寄生线虫的趋化性和化感信号转导途径在防治上的应用Fig.1 Application of chemotaxis of plant-parasitic nematode and the transduction pathway of semiochemical signals in nematode control

2 根结线虫和大豆孢囊线虫的趋化性差异

由于根结线虫（root-knot nematode，RKN）和孢囊线虫（cyst nematode，CN）所引起的危害在植物寄生线虫中达到80%，所以对这两种线虫的研究比较多。这两种线虫都是定居性内寄生线虫，在植物根部存在时，卵孵化成二龄幼虫（J2）识别根际释放的信号寻找并定位寄主，但根结线虫的广寄主范围与孢囊线虫的相对窄寄主范围说明孢囊线虫对寄主识别的信号可能具有特异性，例如大豆孢囊线虫（SCN）的寄主主要是大豆，而根结线虫能够侵染超过2 000种植物。Wang等［6］研究发现，无论是寄主（大豆和辣椒）还是非寄主（万寿菊）的活体根尖，RKN均能被吸引，而SCN只能被大豆根吸引，说明大豆孢囊线虫的寄主专化性；但是大豆、辣椒和万寿菊根提取物和渗出物都吸引SCN，但排斥RKN；线虫吸引和排斥的行为表明两种线虫识别的主要化学信号的差异，因为根提取物和根渗出物只包含水溶性化学物质，而活体根尖包含了挥发性的、水溶性和非水溶性的物质，所以不同的组织材料包含不同的化学物质导致吸引的差异，说明线虫化感物质的复杂性。

识别的差异还表现在对寄主根的识别部位上，大多数RKN对寄主根的识别位于根尖的1.5 mm内［37］，而SCN则 位于根尖的5 mm内［29］，这 与其他报道一致：RKN主要被吸引到根尖的伸长区并在该处侵入［38］，SCN能够侵入根尖更广泛的部位［39］。这些差异可能与根际微环境酸性pH有关，因为利用pH指示剂表明，根尖伸长区的pH＜5，例如玉米［40-41］、番茄和模式豆科植物苜蓿（Medicago truncatula）［37］。试验证明，根结线虫被吸引的最佳pH范围（4.5-5.5）低于大豆孢囊线虫的pH范围（5-5.5）（图2），表明RKN对酸的忍耐范围比SCN强［42-43］，间接的说明根尖不同部位对两种线虫的吸引差异的原因。Wang等［43］研究结果进一步证明，CO2吸引线虫不是缘于CO2梯度，而是CO2改变了胶中的pH梯度。SCN在碱性条件下也有很强的吸引能力，而且有两个pH吸引范围：pH 8.4-8.8和pH 9.5-10，但RKN和SCN线虫浓度一样时，没有明显的吸引，在RKN线虫高浓度时（10×）表现为与SCN相似的吸引范围，但比较微弱（图2）［42］。这些结果同样说明，SCN对碱的敏感性比RKN强，RKN具有强的耐碱性。目前还不能解释为什么会出现有两个pH范围，分子信号的挖掘可能会解释这一现象。另外，其他线虫诸如昆虫病原线虫对碱有两个最适积聚浓度［44］，模式秀丽隐杆线虫能够被吸引的现象可达到pH=10，但当pH＞10.5时，产生强烈的排斥或者躲避［45］。这些结果表明，酸碱都影响线虫的化感识别。

SCN和RKN对盐的趋化性根据研究方法不同其结果有所差异（图2）。Beeman 等［46］利用微流控芯片（microfluidic chips）方法研究表明：SCN的J2能够被MgCl2、KNO3和NH4NO3吸引，但对KCl、Na2SO4或者ZnSO4没反应。Hosoi 等［47］利用琼脂塞（agar plug）做吸引实验发现，0.5 mol/L KNO3和硝酸盐类似物能够吸引SCN。利用琼脂胶吸引实验表明，SCN被MgCl2吸引，但对Na2SO4和NaCl没反应。Castro等［48］利用琼脂胶介质发现，RKN对Cl-具有强烈的排斥反应。孟丽等［49］利用琼脂糖平板培养基测试发现Cl-和SCN-盐、Ba（NO3）2、NH4NO3、Mn（NO3）2、KH2PO4、K2HPO4、K2CO3、KOH、NaOH等对M. incognita均有排斥作用。Hua等［42］利用Pluronic胶系统［37］检测发现，所有盐（NaCl、KCl、KNO3、MgCl2、MgSO4和Na2SO4）都能够吸引SCN，不同盐的积聚模式不一样，而且Na2SO4、KCl和MgSO4对SCN具有诱杀作用，即线虫先被吸引过来，然后由于化学剂量效应使线虫死亡，这对线虫防治非常有意义。诱杀依赖剂量效应的现象在其它实验中也得到证实，Wang 等［6］利用反相高压液相色谱分离根系分泌物发现，极性小的组分对SCN具有很强的吸引作用，而且表现非常明显的剂量诱杀现象，但对根结线虫具有很强的排斥作用。这种依赖剂量的诱杀现象在SCN对不同氨基酸的趋化实验中也被发现（未发表）。这些不同的现象说明线虫对这些化感物质的识别是受很多因素影响，相应的感觉器官控制通路可能各异。

线虫对这些化学物质趋避结果的差异可能与所检测的线虫种类、分离株系、所用植物组织材料或检测的介质系统有关。Pluronic胶系统操作简便、快捷、高效，可实时观测到线虫的运动轨迹，已成功观察到了植物根部及其化学物质对线虫的吸引以及线虫的行为学，是目前研究线虫趋化性和行为学的最佳介质［6，25，27，33，37，42-43，50-53］。利用这个系统结合盐离子微电极检测到SCN最佳趋化Cl-浓度范围是171-256 mmol/L，低于这个范围浓度没反应，高于这个范围浓度产生躲避反应。但RKN对2 mol/L NaCl的反应不同，M. hapla线虫高浓度时才有趋化反应，低浓度无反应（图2）；M. incognita无论高浓度还是低浓度对2 mol/L NaCl均无反应，这些再次说明RKN对盐的耐性比SCN强。整体来说，RKN对于酸碱盐的忍耐性远远大于SCN，也间接表明了根结线虫的广寄主性和大豆孢囊线虫的窄寄主性不仅与寄主释放的信号物质有关，可能还与环境化学信号有关。结合两种线虫对酸、碱和盐的趋避特征，大豆孢囊线虫对酸、碱和盐的反应更为敏感，是用于研究对酸碱盐趋避作用比较理想的典型植物寄生线虫。

在趋化性研究中，一个普遍存在的现象是线虫的积聚性，RKN线虫积聚成球的现象非常普遍，但是不同RKN种和小种之间反应存在差异［37，53］。M. hapla对氰化钾产生积聚性的基因被定位到线虫的遗传连锁群L8上，这是第一个被标记的专性植物寄生线虫的积聚基因［53］。对于大豆孢囊线虫，Hua等［42］首次发现SCN能够对 NaCl形成的浓度梯度在化学分配器外面聚成紧密的球状，而对其它酸、碱或盐的趋化性显现为松散的聚集（图2）。此外也观察到两种线虫被吸引到根部和进入根部的时间也有差异，RKN到达根尖部一般会停留一段时间，不直接进入根部，而大豆孢囊线虫到达根部直接侵染进入；在根暴露于线虫24 h时特别明显，例如，在同样线虫浓度的胶中，大豆根尖及其根围没有大豆孢囊线虫聚集，但大豆根尖处有聚集成堆的根结线虫，这种现象在其它作物-根结线虫互作中普遍存在，这和前面讲到根结线虫比大豆孢囊线虫更容易聚集成球一致。这种积聚成球或散状的原因被认为是线虫之间不同的通讯交流导致的，说明根结线虫之间的通讯交流比大豆孢囊线虫之间的通讯交流更为活跃。而形成这种通讯交流方式的原因之一可能是由于线虫产生的蛔甙信息素产生的［35-36，54］，另外，神经元、分子信号受体和信号整合也是导致线虫种群内部通讯行为的原因［55-57］。

图2 大豆孢囊线虫和北方根结线虫的趋化性比较［42］Fig.2 Comparison of chemotaxis of H. glycines and M. hapla

3 植物寄生线虫化感机制研究进展

线虫对化学信号的趋避性、由浓度效应引起的诱杀现象及积聚模式都与线虫的化感神经系统密切相关。目前对线虫的化感系统研究比较清楚的是模式秀丽隐杆线虫。秀丽隐杆线虫作为模式线虫的原因包括以下几个特征：生活周期短（大约3-4 d），在培养基上容易培养，基因组小，且是世界上第一个被阐明所有体细胞（959个）发育谱系和神经元（302个）相互作用的多细胞生物，而且能够遗传转化产生突变体。线虫能够检测并响应多种感觉信号，如化感行为、渗透压、触觉、光敏感觉等，这些行为由不同的神经元所调控。化感神经元通常是通过感觉器的开口结构直接将感觉纤毛暴露到外界环境中，感知不同的化学信号进而产生趋避性或影响线虫活力及休眠等。化感神经元具有双边对称的特点，包括11对头感器，2对尾感器及3对内阴唇神经元［58］。植物寄生线虫的感觉神经器官与秀丽隐杆线虫的感觉神经器官在结构上基本相似［59-60］。

在秀丽隐杆线虫研究中发现，化感信号转导依赖于G蛋白偶联受体（G-protein Coupled Receptors，GPCRs）信号通路、由鸟苷酸环化酶（guanylate cyclase，GCY）（DAF-11和ODR-1）催化合成的第二信使cGMP信号通路，就是环状核苷酸门控CNG通道（TAX-2和TAX-4），或由多不饱和脂肪酸PUFA介导的瞬时感受器电位TRPV通道（OSM-9和OCR-2）［58，61］（图1）。秀丽隐杆线虫基因组编码大约1 000 个GPCRs，大多数是化感受体，如ODR-10作为气味配体的受体；G蛋白在调控GPCR蛋白的下游中起着非常重要的作用，如类似Gi蛋白（Gi-like protein）的ODR-3作用于GPCR蛋白的下游调控嗅觉和伤害性受体；而G蛋白下游的tax-4/tax-2基因编码的环状核苷酸cGMP门控的离子通道或OSM-9/OCR-2组成的TRPV通道打开，使神经细胞去极化［58］。目前对线虫的集聚行为研究最多和最清楚的是调控秀丽隐杆线虫的取食行为的神经肽受体集聚基因NPR-1，而NPR-1基因是可表达的并与哺乳动物神经肽NPY受体相似的GPCR；NPR-1的内源性配体是FMRF酰胺多肽（FMRFamide like neuropeptides，FLPs）18和21，在不同的O2浓度下，通过感应神经表达的鸟苷酸环化酶GCY受体能调控线虫的集聚及平衡线虫的吸引和排斥［62-64］。

Yan和Davis［65］克隆了3个与秀丽隐杆线虫同源的大豆孢囊线虫gcy基因，这些基因定位在神经环、头感器和尾部神经元里，但功能未知。模式秀丽隐杆线虫能够进行遗传转化来鉴定神经通路的功能，但植物寄生线虫不能进行遗传转化，所以与模式线虫相比，植物寄生线虫在神经通路方面的知识非常有限。近些年发展的RNA干扰技术对于植物寄生线虫的候选基因功能研究和验证提供了强有力的反向遗传学方法［66-67］。Dong等［68］发现，低剂量的月桂酸对RKN吸引，但高剂量对RKN具有诱杀作用，这与前面提到的盐对SCN的诱杀是一致的。深入研究发现，这是受线虫的flp18基因调控，但具体调控受体不清楚。近期我们研究团队克隆了与秀丽隐杆线虫同源的13个SCN-flp基因，并对其中flp1和flp11进行了功能研究，发现这两个基因进行沉默后降低了SCN对植物的吸引，外源肽处理线虫后flp1提高了SCN对植物的吸引（未发表）。植物寄生线虫中存在同源的flp基因［69-72］，但对植物寄生线虫flp基因的G蛋白偶联受体研究甚少，而这些受体是研发新的杀线虫剂的靶标位点。Kumari 等［72］根据水稻RKNM. graminicola转录组数据，克隆了9个flp基因和flp-18部分GPCR受体基因发现，RNA干扰影响了线虫的侵入能力。神经肽样蛋白NLP在植物寄生线虫中也有报道，Warnock等［73］在M. incognita中鉴定了7个nlp基因，在马铃薯孢囊线虫G. pallida中鉴定了4个nlp基因，其中应用外源肽处理线虫发现能够抑制线虫的趋化性，NLP15b能够抑制线虫的趋化性，但对侵入没有影响；进一步利用转基因芽孢杆菌分泌大量的NLPs，能够降低90%线虫繁殖，说明这些神经肽是潜在的杀线虫剂。有趣的是，这些神经肽对昆虫病原线虫Steinernema carpocapsae和C. elegans的吸引基本上没有作用，可能原因是与植物寄生线虫的同源比率较低，这个结果证明了这些肽对植物寄生线虫的独特性。Bresso 等［74］根据M. incognita基因组序列和GPCR包含有7个跨膜螺旋结构的特征，预测了117个候选GPCR，其中大多数是与线虫化感系统和神经肽的GPCR有关，这些GPCR的鉴定及其未来功能的研究对于开发有效的杀线虫剂提供了良好的开端。

Shivakumara等［52］在M. incognita中克隆了4个与秀丽隐杆线虫同源的化感基因（odr-1，odr-3，tax-2和tax-4），odr-1与gcy基因同源，odr-3是G蛋白，包含Gα蛋白区域，tax-2/tax-4编码cGMP离子通道，RNA干扰这些基因导致M. incognita线虫的趋化性降低，而且也降低了对低剂量信息素asc#18的趋化性，对高剂量asc#18没有影响，说明这些基因与寄主识别有关，信息素介导的信号受这些下调感应基因的影响。生物信息学分析表明，这些基因和根结线虫亲缘关系比较接近，但与孢囊线虫关系相对比较远，前面讲到RKN和SCN对相同信号的不同反应可能解释了这一现象。虽然感应受体或配体同源，但不同线虫表现出遗传和功能多样性却是非常普遍的现象［75］。

4 总结与展望

前面介绍了植物寄生线虫对植物根部、代谢产物及化学物质的趋化反应，具体分为3个阶段（长距离、短距离和局部）（图1），特别是比较了大豆孢囊线虫SCN和根结线虫RKN对酸碱盐氨基酸的趋化反应差异，并对植物寄生线虫的化感机制进展进行总结。但相对于秀丽隐杆线虫化感机制研究，植物寄生线虫化感机制研究非常少，而且由于寄生方式的独特性，虽然序列上有一定的保守，但功能上有差异，前面论述也表明了该观点，因此分子机制有待深入研究，特别是信号转导途径需要更深入的研究。目前主要对环状核苷酸门控CNG通道调控根结线虫有初步研究，对瞬时感受器电位通道在植物寄生线虫上仍属空白。从应用角度（图1），鉴定有效调控植物寄生线虫趋化和排斥的天然调节剂，来控制线虫对寄主的搜寻，或者发现兴奋剂使线虫兴奋，在达到寄主前能量消耗殆尽而终止线虫的定位和侵染；从线虫化感信号途径来讲，GPCR受体及其通道基因的挖掘将是开发新一类杀线虫剂潜在的靶标分子，通过RNAi干扰线虫信号转导途径而影响线虫的定位和侵染，从而在线虫侵染早期就能达到防治目的。因此，深入探索线虫与植物在预寄生阶段的趋化特性和机制具有重要的应用价值和理论意义。