碱水解法测定乳脂肪方法的改良应用

杨爱君，罗少杰，曹学思，纪坤发，童 骏

广东燕塘乳业股份有限公司，广东广州 510700

0 引言

乳脂肪是乳制品重要的营养物质，也是乳制品质量的主要理化指标之一；牛乳脂肪的检测一直以来是常规检测的重要项目。目前《GB 5009.6—2016 食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》[1]中第三法碱水解法和第四法盖勃法均适用于乳制品、婴幼儿配方食品中脂肪的测定。在乳制品脂肪测定的过程中，由于酪蛋白钙盐吸附了大部分的游离脂肪，难以直接使用溶剂萃取，所以需要先用氨水溶解酪蛋白钙盐，进而在碱性条件下使乳脂肪游离[2]。由此可见，碱水解法更适用于乳制品脂肪含量的测定。作为乳制品脂肪含量测定的仲裁方法[3]，碱水解法具有稳定、准确等优点[4]，但其检测时间长，消耗试剂多，成本相对较高[5]。

本文主要探讨《GB 5009.6—2016 食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》第三法碱水解法的改良应用，在碱水解法测定过程中，对抽提、蒸干、称量等步骤进行简化操作，减少试剂消耗，提高检测效率。为了证实本方法的检测结果准确可靠，根据《GB/T 27404—2008 实验室质量控制规范 食品理化检测》[6]的要求对该方法的精密度和准确度进行了验证。同时参加了乳脂肪的能力验证，证明改良后的检验方法可以应用到日常的检测中。

1 材料与方法

1.1 试验仪器

ML204型分析天平（梅特勒－托利多仪器有限公司），感量0.0001 g；DHG-9023A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；HH-1型数显电子恒温水浴锅（国化电器有限公司）；100 mL具塞量筒；多用途离心机（德国FUNKE GERBER公司）；抽脂瓶。

1.2 试验试剂

氨水（广州化学试剂厂，分析纯）；无水乙醇（广州化学试剂厂，分析纯）；刚果红（上海远航试剂厂，分析纯）；乙醚（广州化学试剂厂，分析纯）；石油醚（广州化学试剂厂，分析纯）。

1.3 试验方法

1.3.1 方法原理

用无水乙醚和石油醚抽提样品的碱（氨水）水解液，通过蒸发去除溶剂，测定溶于溶剂中抽提物的质量[1]。

1.3.2 试验步骤

《GB 5009.6—2016 食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》碱水解法和改良法的详细试验步骤见图1。

图1 试验步骤

1.4 计算公式

1.4.1 国标法试样中脂肪含量按公式（1）计算

式中：X为试样中脂肪含量，单位为克每百克（g/100g）；m1为恒重后脂肪收集瓶和脂肪的质量，单位为克（g）；m2为脂肪收集瓶的质量，单位为克（g）；m3为空白试验中，恒重后脂肪收集瓶和抽提物的质量，单位为克（g）；m4为空白试验中脂肪收集瓶的质量，单位为克（g）；m为样品的质量，单位为克（g）；100为换算系数。

1.4.2 改良法试样中脂肪含量按公式（2）计算

式中：

X ——为试样中脂肪含量，单位为克每百克（g/100g）；

W ——为试样的重量，单位为克（g）；

W1——为烧杯的重量，单位为克（g）；

W2——为烧杯加脂肪的重量，单位为克（g）；

V0——为醚层总体积，单位为毫升（mL）；

V1——为移取醚层的体积，单位为毫升（mL）；

100 ——为换算系数。

2 结果与分析

2.1 改良法的优点

2.1.1 抽提

《GB 5009.6—2016 食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》中第三法碱水解法抽提时使用抽脂瓶，抽提后用倾倒的方法将抽脂瓶内提取物转移至脂肪收集瓶内。实际操作中每次使用混合试剂清洗后，瓶颈内壁上仍不可避免残留提取物，同时，此操作需在完整保留水层的情况下，将醚层全部倒出，因此，对试验人员的要求较高。

改良后使用具塞量筒替代抽脂瓶，抽提后可以直接读取醚层的体积，再用移液管精确移取一定体积的醚层，避免了未知的残留，移取量更加准确，操作也更加简便。

2.1.2 蒸干

在蒸干步骤中，改良法采用烧杯替代了《GB 5009.6—2016 食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》中第三法碱水解法的脂肪收集瓶，通过增大容器口径，加快有机溶剂的挥发速度，缩短试验时间，提高检测效率。

2.1.3 称量

《GB 5009.6—2016 食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》中第三法碱水解法国标法通过将醚层全部倒出后蒸干、恒重得到试样中脂肪的含量，但无法避免有部分醚层残留在瓶内，从而影响检测结果。改良方法使用了脂肪的体积比换算得到试样中脂肪的含量，能准确读取脂肪的总体积和移取量，结果更具有可信度。

2.2 精密度试验

选择了7 个浓度梯度的样品，每个样品均使用《GB 5009.6—2016食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》第三法和改良方法分别测定6 次，代入公式得到脂肪含量的试验数据，同时，计算本次试验结果的变异系数和两种方法试验结果的差值D，见表1。

根据《GB/T 27404—2008 实验室质量控制规范 食品理化检测》附录F，当被测组分含量在1.00%～10.00%时，测试结果的变异系数＜2.00%；当被测组分含量在0.10%～1.00%时，测试结果的变异系数＜2.70%[6]。由表1可知，本次试验结果的变异系数为0.26%～1.73%，说明该改良方法的精密度符合上述标准要求。

2.3 改良法与国标法的显著性比较试验

比较改良方法和《GB 5009.6—2016 食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》第三法国标法对7 个样品的测定结果，其差值D的绝对值均小于0.10 g/100 g，见表1。使用t检验法对改良法和国标法的测定结果进行显著性比较，通过SPSS软件计算得到t=0.082。查t分布表，当自由度n=6时，t0.05，6=2.447。结果显示t＜t0.05，6，说明改良法和国标法的检测结果无显著性差异，即两种方法的检测结果一致，可使用改良方法替代《GB 5009.6—2016 食品安全国家标准食品中脂肪的测定》第三法国标法进行乳及其制品的日常检测[7，8]。

表1 重复性试验结果（n=6）

2.4 准确度试验

2019 年使用改良方法参加了华测检测认证集团股份有限公司组织的奶粉中营养成分的测定能力验证（编号：CTI-CF13125121），2020年使用改良方法参加了中国检验检疫科学研究院测试评价中心举办的奶粉中蛋白质、脂肪的测定能力验证（编号：ACA SPT972），均得到满意结果，能力验证具体结果见表2。

根据《GB/T 27404—2008 实验室质量控制规范 食品理化检测》的要求，当被测组分含量＞10000 mg/kg时，测定值与真值的偏差范围应＜5.00%[6]。由表2可知，准确度试验结果的偏差为1.89%～3.90%，说明该改良方法的准确度符合上述标准要求。

表2 能力验证试验结果

3 结论

试验的结果表明，①通过具塞量筒替代抽脂瓶；②用脂肪的体积比换算脂肪的质量；③使用烧杯替代脂肪接收瓶，增大口径使有机溶剂快速挥发，缩短试验时间；④减少抽提次数，降低试剂损耗等四方面的改良。改良方法测定生牛乳、巴氏杀菌乳和发酵乳等乳及其制品的脂肪含量，在操作过程中具有抽提简单化、节省检测时间、检测器具方便清洗等优点。使用《GB 5009.6—2016 食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》第三法国标法和改良方法重复测定7 个浓度梯度样品，得到该方法的变异系数在0.26%～1.73%，并且差异显著性分析表明该方法可替代《GB 5009.6—2016 食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》第三法国标法。同时，该方法也连续两年通过了能力验证，且测定值与指定值的偏差为1.89%～3.90%。改良方法的精密度和准确度均符合《GB/T 27404—2008 实验室质量控制规范 食品理化检测》的要求，说明该方法有较好的重复性、稳定性和准确性。可见在日常检验中，利用该方法对乳及其制品的脂肪含量进行检测，具有一定的应用价值。