聚苯胺/聚乳酸复合纳米纤维表面形貌对生物相容性的影响

2021-08-21刘荣涛张诗洋黄兴文朋小康闵永刚

化工进展 2021年8期

刘荣涛，张诗洋，黄兴文，朋小康，闵永刚，2

（1广东工业大学材料与能源学院，广东广州 510006；2东莞华南设计创新院，广东东莞 523808）

聚苯胺（PANI）因为良好的加工性、优良的导电性和生物相容性被认为是组织工程和再生医学的潜在候选材料[1-3]。许多研究表明电刺激下PANI能够调节细胞附着、增殖、迁移和分化[4-6]。但PANI在体液环境下（pH=7.4）会发生脱掺杂，使其导电性极大地减弱[7]，不能很好地发挥自身的电活性优势，从而使得PANI基可降解纳米纤维在促进细胞增殖分化方面的应用受到一定限制。然而，大量文献表明，无外加电场下PANI基导电可降解纳米纤维仍具有良好的生物相容性[8-9]，并且不同类型酸掺杂剂得到的PANI基导电可降解纳米纤维增强生物相容性效果也表现出差异[10-11]，这种现象可能是由不同PANI形貌对细胞活性的影响产生的。

本文将静电纺丝法得到的聚乳酸纳米纤维等离子体处理后，选择酒石酸作为PANI原位氧化聚合过程中的酸掺杂剂，考察酒石酸与苯胺单体不同摩尔比下PANI/PLA复合纳米纤维生物相容性表现。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

苯胺（AN）、过硫酸铵（APS）、DL-酒石酸，Sigma Aldrich公司；聚乳酸（PLA，Mw=60000），上海阿拉丁试剂有限公司；N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM），天津市富宇精细化工有限公司；磷酸缓冲液（PBS），Biosharp，北京Labgic科技公司；低糖DMEM培养基，Gibco，美国Thermo Scientific公司；胎牛血清（FBS）、碱基磷酸酶（ALP），中国碧云天生物技术公司；MTT噻唑蓝，德国Bioforx公司；FITC标记的鬼笔环肽，北京Solarbio科技公司。

静电纺丝机，DP-30型，天津云帆科技公司；等离子体清洗机，PCE-6型，美国MTI公司；傅里叶变换红外光谱仪（FTIR），Niconlet iS50型，美国Thermo Scientific公司；场发射扫描电子显微镜（FESEM），Hitachi-SU8220型，日本日立公司；接触角分析仪，OCA 15 plus型，德国；酶标仪，Synergy HTX型，美国BioTek公司；共聚焦显微镜，A1型，日本尼康公司。

1.2 PLA静电纺丝纳米纤维制备

一定质量的PLA颗粒加入在DCM和DMF（质量比为7∶3）混合液中，搅拌直到溶解，得到质量分数为10%的PLA混合溶液。将PLA溶液装入注射器中，连接高压电源，设置电压15kV、距离15cm。

1.3 酒石酸掺杂聚苯胺/聚乳酸复合纳米纤维的制备

将酒石酸与苯胺单体分别按照1∶1、1∶2和1∶4的摩尔比溶解在40mL去离子水中，冰浴下搅拌1h，将等离子体（plasma）处理的PLA纳米纤维浸入在上述混合溶液中。然后将与苯胺相同物质的量的APS溶解在10mL去离子水中，冰浴下搅拌30min充分溶解后，逐滴加入到酒石酸与苯胺的混合溶液中，持续搅拌反应24h，取出纤维薄膜后无水乙醇清洗，40℃真空干燥8h。将酒石酸与苯胺单体摩尔比为1∶1、1∶2和1∶4得到的聚苯胺记为PT1、PT2和PT4，对应得到的PANI/PLA复合纳米纤维标记为PLT1、PLT2和PLT4。静电纺丝纳米纤维和PANI/PLA复合纳米纤维的制备过程见图1。

图1 PLA静电纺丝纳米纤维和PANI/PLA复合纳米纤维制备

1.4 PANI/PLA复合纳米纤维支架的表征

通过场发射扫描电子显微镜（FESEM）和透射电子显微镜（TEM）观察不同摩尔比酒石酸掺杂的PANI/PLA复合纳米纤维表面形貌和结构。为了确定PANI完全负载在PLA纳米纤维上，对制备的PANI/PLA复合纳米纤维进行FTIR测量。通过接触角实验评价PANI/PLA复合纳米纤维支架的润湿性。

1.5 PANI/PLA复合纳米纤维生物相容性表征

采用人骨肉瘤细胞（HOS，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）活性作为生物相容性指标。HOS细胞在含有10%FBS、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的低糖DMEM培养基中，于37℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育。细胞增殖试验开始之前需要将HOS细胞接种在PANI/PLA复合纳米纤维上。将PANI/PLA复合纳米纤维放入96孔板中，完全覆盖培养板底部，紫外杀菌30min，以3×104每孔的密度接种到PANI/PLA复合纳米纤维上，同时设置空白组和对照组，孵育1天、3天、5天，每隔2天更换培养基。

用细胞增殖检测（MTT）法检测PANI/PLA复合纳米纤维细胞活性。碱基磷酸酶活性（ALP）采用碱性磷酸酶检测试剂盒方法测定。细胞荧光免疫染色实验用FITC标记的鬼笔环肽染色细胞膜外肌动蛋白，使用共聚焦显微镜观察细胞染色情况。

2 结果与讨论

2.1 PANI与PANI/PLA复合纳米纤维性能

2.1.1 表面形貌

图2为不同酒石酸和苯胺摩尔比得到的PANI和对应PANI/PLA复合纳米纤维表面形貌。从图2(a)可以看出，酒石酸和苯胺摩尔比为1∶1时的PT1形貌为纳米颗粒；摩尔比为1∶2时的PT2形貌主要为纳米纤维；摩尔比为1∶4时PT4呈现出明显的纳米空心管状纤维结构，表面有明显的小毛刺。为进一步观察PANI纳米纤维的结构，通过TEM表征酒石酸和苯胺摩尔比为1∶2和1∶4得到的PANI纳米结构（图3）。从图3可以看出，酒石酸与聚苯胺摩尔比为1∶2的聚苯胺（PLT2）为实心纳米纤维，而酒石酸与聚苯胺摩尔比为1∶4的聚苯胺（PLT4）有明显的空心管状结构，这与SEM结果表现一致。图2(b)所示为对应的PANI/PLA复合纳米纤维SEM图，可以看出不同酒石酸和苯胺摩尔比的PANI主要是覆盖在PLA纳米纤维表面，形貌与对应的纯PANI表现一致，酒石酸掺杂的PANI/PLA复合纳米纤维仍能保持良好的纤维形貌和多孔纤维结构。SEM结果表明，酒石酸掺杂的PANI成功负载在PANI/PLA复合纳米纤维表面。

图2 不同酒石酸和苯胺摩尔比的PANI形貌和对应的PANI/PLA纳米纤维形貌

图3 酒石酸与聚苯胺摩尔比为1∶2和1∶4的聚苯胺TEM图

在酒石酸作为掺杂剂生成PANI过程中，酒石酸作为模板附着在PLA纳米纤维表面，氧化剂存在下，苯胺分子在酒石酸表面聚合产生的苯胺低聚物，进而相互连接形成PANI纳米纤维[12]。反应体系中酒石酸浓度过低时，不足以使苯胺低聚物相互连接，因此得到的PANI形貌多表现为纳米颗粒或短棒状[13-14]。酒石酸浓度增加，使得苯胺低聚物相互连接的过程继续进行，生成PANI纳米纤维状和空心纳米管状结构[15]。与颗粒状PANI相比，纳米纤维状PANI表现出更强的分子排列有序性，分子链规整性好，并且纳米管状结构PANI具有更大的比表面积[16-17]。

2.1.2 表面成分分析

通过FTIR说明PANI/PLA复合纳米纤维表面组成，不同酒石酸和苯胺摩尔比的PANI和PANI/PLA复合纳米纤维的FTIR如图4。在纯掺杂PANI的FTIR图谱中[图4(a)]，1568cm-1、1492cm-1、1298cm-1和1141cm-1的峰分别对应醌环伸缩、苯环C==C伸缩、苯环C—N伸缩和==CH伸缩[18]。在PANI/PLA复合纳米纤维FTIR图谱中[图4(b)]，除了PANI的特征峰外，还可以看到PLA特征峰，分别为1092cm-1和1184cm-1代表的C—O伸缩振动峰，1757cm-1代表的C==O伸缩振动峰[19]。结果表明，酒石酸掺杂的PANI能够在PLA纳米纤维表面成功负载。

图4 酒石酸与苯胺摩尔比为1∶1、1∶2和1∶4的聚苯胺及对应聚苯胺/聚乳酸复合纳米纤维FTIR图谱

2.1.3 接触角分析

支架的润湿性影响细胞的黏附、迁移和增殖[20-21]，通常通过材料与水的接触角来评价。在室温下，将50μL去离子水滴在纳米纤维表面，每种纳米纤维取3个样品，取3次测试接触角的平均值。图5所示为水滴在1s内与纳米纤维膜上的接触角。可以看出，经过plasma处理的PANI/PLA复合纳米纤维的接触角明显减小。对应的PLT1、PLT2和PLT4的接触角分别为76.3°、64.3°和61.4°，与PLA接触角为（111.2°）相比，分别降低了34.9°、46.9°和49.8°，纳米颗粒状形貌PANI的PLT1减小最少，纳米纤维的PANI的PLT2和PLT4减少的较多。不同PANI形貌增加了PANI/PLA体系的表面能，纳米纤维的取向结构有助于水分子的扩散，而管状结构增加了接触面积，使得接触面积增加。在实际测试过程中，观察到纳米纤维初始与水接触时，表现出不同的接触角，与水接触5s后，接触角变为0°，表现出良好的亲水性[22]。这是因为经plasma处理后，PLA纳米纤维表面会产生亲水含氧基团（如—OH、—COOH等），与酒石酸掺杂原位聚合的PANI共同作用，最终使PANI/PLA复合纳米纤维完全湿润，表现出良好的亲水性[23]。

图5 PLA纳米纤维和不同酒石酸与苯胺摩尔比得到的PANI/PLA复合纳米纤维表面接触角

2.2 静电纺丝纳米纤维的生物相容性

生物支架材料除自身具有一定的力学性能和一定的降解性外，最重要的是能促进细胞在表面的黏附、生长和增殖，即要具有一定的生物相容性[24]。通过HOS在PLA和PANI/PLA复合纳米纤维上细胞活性表征生物相容性，碱性磷酸酶活性的高低反映成骨细胞活性及状态，细胞免疫荧光染色观察细胞肌动蛋白状态说明细胞生长黏附状态。

图6和图7分别为接种在PLA和PANI/PLA复合纳米纤维上的HOS细胞培养1天、3天、5天后的细胞活性和孵育7天的细胞ALP活性。可以看出，PLA和PANI/PLA复合纳米纤维表面细胞活性逐渐提高，PANI/PLA复合纳米纤维细胞活性和7天的ALP活性高于对照组PLA纳米纤维，细胞活性和ALP活性顺序为PLT4>PLT2>PLT1。从润湿性角度分析，PANI/PLA复合纳米纤维都表现出良好的亲水性，因此对细胞的黏附和生长没有影响差异。能够影响细胞活性和ALP活性的只有酒石酸与苯胺摩尔比不同形成的不同形貌的PANI，从这点来看，纳米纤维状的PLT2和PLT4生物相容性要强于纳米颗粒状形貌的PLT1，并且具有纳米空心管状结构的PLT4表现最好。

图6 在PLA纳米纤维和PANI/PLA复合纳米纤维上培养1天、3天和5天细胞活性

这是因为PLA纳米纤维表面附着的PANI能够增加体系的接触位点和极性，更有利于细胞的黏附和生长，特别是纳米纤维状形貌的PANI具有较高的有序度和取向，更利于细胞黏附和迁移，空心管状纳米纤维结构提供了更大的接触面积和表面能，使得细胞更倾向于在其表面黏附和生长，从而表现出更加优异的生物相容性[16,25]。细胞免疫荧光染色结果进一步证实以上结论，图8中可以看到肌动蛋白和细胞形态在不同纳米纤维表面的状态。HOS细胞的肌动蛋白束在PLA和PANI/PLA复合纳米纤维上皆表现出良好伸展状态，细胞生长密度表现与细胞活性和ALP活性结果一致。以上结果表明，酒石酸掺杂的PANI/PLA复合纳米纤维具有良好的生物相容性，不同酒石酸和苯胺摩尔比得到的PANI形貌对PANI/PLA复合纳米纤维生物相容性增强表现有所不同，纳米纤维状的PANI对生物相容性的增强效果明显优于纳米颗粒状PANI，而具有空心管状结构的PANI对生物相容性增强作用更优。