穗花杉双黄酮抑制小儿血管瘤内皮细胞体外增殖实验研究

傅 娟,刘媛媛,李 霞

(1.固原市人民医院,宁夏 固原 756000;2.合阳县人民医院,陕西 合阳 715316;3.西安高新医院,陕西 西安 710075)

小儿血管瘤(Infantile hemangioma,IH)是一种良性血管瘤，在出生后迅速扩散，最终纤维脂肪组织所替代[1]。大部分血管瘤可自行消退，在4%～5%的患儿中，可能导致严重的疾病，包括：甲状腺功能减退、弱视、肝衰竭、溃疡和出血、甚至危及存活[2-4]。药物治疗、手术切除和硬化治疗作为常见的血管瘤治疗方法均不能获得理想的治疗效果[5]，因此在临床和基础研究上，寻找和探索安全有效的血管瘤治疗药物和方法显得极为重要。由于中药活性单体来源丰富，价格低廉和药效稳定，越来越多的科研工作者致力于中药单体抗癌的研究，比如雷公藤红素可抑制胃癌细胞体外增殖[6]、南方红豆杉提取物可抑制人前列腺癌细胞增殖并促进凋亡[7]，龙葵碱通过调控p53蛋白表达抑制卵巢癌细胞增殖[8]。穗花杉双黄酮(Amentoflame,AF)是一种从穗花杉中提取的黄酮类化合物，现代药理研究[9-10]证明，AF具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种作用。近年来有研究[11]报道，AF具有抑制血管生成的作用，并能够抑制肿瘤细胞增殖，但其对IH内皮细胞体外增殖以及β-catenin信号通路的影响尚不清楚。本研究旨在探讨AF对IH内皮细胞体外增殖的影响及其机制，藉此为IH的临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 IH内皮细胞购自上海美轩生物科技有限公司。AF购于北京百诺威生物科技有限公司，纯度≥98%，AF由 DMSO 溶解。DMEM培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗均购自美国Gibco 公司，MTT 试剂购于美国Promega 公司，SDS-PAGE配制试剂盒购于中国碧云天生物公司,BCA 蛋白浓度测定试剂盒购于美国赛默飞公司，RIPA 裂解液购于中国碧云天生物公司，细胞周期试剂盒购于美国BD公司,Cyclin D1、p21、β-catenin 和GAPDH 抗体均购于美国Cell Signal Technology公司，免疫组化试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。流式细胞仪购于美国BD Pharmingen 公司，荧光定量PCR仪购于德国耶拿公司，高速冷冻离心机、深低温冰箱购于美国赛默飞公司，全自动酶标仪和细胞培养箱购于美国Thermo 公司，转膜仪购于美国Bio-RAD 公司，倒置显微镜购于德国Zeiss公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：IH内皮细胞由DMEM培养基培养在37 ℃，5% CO2培养箱中，DMEM 完全培养基包含1% 双抗，10%胎牛血清，每3 d更换培养基，细胞汇合度达到70%～80% 时，对细胞进行消化、传代和接种。

1.2.2 MTS法检测AF对IH内皮细胞活力的影响：消化传代细胞，用DMEM完全培养基重悬细胞，得到细胞浓度为2×104个/ml的细胞悬液，每孔接种0.2 ml细胞悬液，次日，弃掉培养基，分别加入含0、25、50、75、125 μmol/L AF的DMEM 完全培养基，每组设置3个复孔，细胞培养24 h后，加入20 μl MTS，继续孵育4 h，酶标仪检测各孔读数，检测波长为490 nm。

1.2.3 细胞周期检测：根据MTS结果，仅选择75 μmol/L AF用于后续实验作为实验组、0 μmol/L AF为对照组。将IH内皮细胞以每孔2×105个/ml的密度接种至6 孔细胞板，次日，弃掉培养基，加入不含AF或含有75 μmol/L AF的DMEM完全培养基，培养24 h后，消化细胞并收集至离心管中,1500 r/min离心5 min。弃去上清，加入预冷70%乙醇，4 ℃固定4 h，参照试剂盒说明书的步骤检测细胞周期。

1.2.4 Western blot 检测增殖相关蛋白表达水平：将小儿血管瘤内皮细胞以每孔2×105个/ml的密度接种至6孔细胞板，次日，弃掉培养基，加入不含AF或含有75 μmol/L AF的DMEM完全培养基，培养24 h后，弃掉培养基，PBS清洗3次，加入RIPA 裂解液，在冰上收集培养24 h后的各组细胞，BCA蛋白检测试剂盒测定提取总蛋白的浓度。将蛋白进行变性并进行SDS-PAGE电泳分离蛋白(每孔上样30 μg)，半干转法转膜后，将膜用5%牛血清白蛋白(BSA)封闭2 h，分别加入一抗β-catenin(1∶1000)、Cyclin D1(1∶1000)、p21(1∶1 000)和GAPDH(1∶1000)稀释液，将膜放入4 ℃冰箱摇床上，孵育过夜，次日加入TBST洗3次，分别加入二抗(1∶3000)稀释液，用ECL 发光液浸膜后，避光孵育 5 min，用凝胶成像仪进行显色反应并拍照记录，用GAPDH作为内参，用Image Lab 3.0软件进行条带定量分析。

1.2.5 实时荧光定量PCR法检测增殖相关基因mRNA表达水平：将IH内皮细胞以每孔2×105个/ml的密度接种至6 孔细胞板，次日，弃掉培养基，加入不含AF或含有75 μmol/L AF的DMEM完全培养基，培养24 h后，弃掉培养基，收集培养24 h后的各组细胞，采用Trizol 法提取总RNA。用反转录试剂盒以总RNA为模板合成cDNA。配制含有2 μl cDNA、6 μl ddH2O、10 μl SYBP Premix Ex Taq 和各1 μl上下游引物的反应体系，进行实时荧光定量PCR反应。反应程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，退火和延伸65 ℃、35 s，40个循环。GAPDH 作为内参，2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA 的相对表达量，各引物序列见表1。

表1 PCR基因引物序列相关信息

2 结 果

2.1 AF对IH内皮细胞活力的影响 见图1。当AF浓度为25、50 μmol/L时，AF对小儿血管瘤内皮细胞活性没有显著作用，当AF浓度为75、125 μmol/L 时，AF显著抑制小儿血管瘤内皮细胞活性，与0 μmol/L AF的对照组相比，其组间差异有统计学意义(P<0.05)，因此，将75 μmol/L AF用于后续实验。

注：与对照组比较，*P<0.05

2.2 AF对IH内皮细胞周期的影响 见表2 。根据AF对IH内皮细胞活力的影响的实验结果得知，75 μmol/L AF可显著抑制IH内皮细胞活性，所以，在周期实验中，仍以75 μmol/L AF组进行研究，与对照组相比，AF组中，处于G0/G1期的IH内皮细胞比例显著增加，处于S期的IH内皮细胞比例显著减少，其组间差异均有统计学意义(均P<0.05)。

表2 两组细胞周期分布比较(%)

2.3 AF对IH内皮细胞增殖相关蛋白 mRNA表达水平的影响 见图2。与对照组相比，AF组中，β-catenin和Cyclin D1 mRNA表达量显著减少，p21 mRNA表达量显著增加，其组间差异有统计学意义(均P<0.05)。

2.4 AF对IH内皮细胞增殖相关蛋白表达水平的影响 见图3。与对照组相比，AF组中，β-catenin和Cyclin D1蛋白表达量显著减少，p21蛋白表达量显著增加，其组间差异有统计学意义(均P<0.05)。

注：与对照组比较，*P<0.05

注：与对照组比较，*P<0.05

3 讨 论

IH是小儿中最常见的良性血管肿瘤，通常在出生后几天内被发现，并经历独特的疾病过程，其中快速增殖阶段之后自发性消退[12]，但仍有10%～15%的患者会因为血管瘤的持续增长而引发各项机体功能障碍[13]。临床上，治疗IH一般采用手术切除，手术切除仅限于一些皮肤部位，但对于一些特殊部位，比如眼、耳和鼻等，则不适宜手术切除[14]，因此寻找用于治疗血管瘤安全有效且低廉的治疗药物极为紧迫。

AF是一种来源于的卷柏的黄酮类中药单体，研究发现其具有抗炎、抗肿瘤、抗辐射、清除自由基的作用[15]，文献报道，AF 具有抑制ECV304细胞迁移的作用，并且能够抑制ECV30细胞体外血管样结构的形成[16]。本研究通过MTS实验和细胞周期实验发现AF可显著抑制IH内皮细胞增殖，实时荧光定量PCR和Western blot探明了AF可显著抑制IH内皮细胞增殖的作用机制，即AF抑制了IH内皮细胞β-catenin，Cyclin D1和p21蛋白和mRNA的表达。β-catenin是一种典型的黏连蛋白，是经典的Wnt信号重要的转录因子，在各类细胞中起着黏连并传递信号的作用[17]，Cyclin D1作为β-catenin的靶蛋白，β-catenin活化可促进细胞周期蛋白D1表达从而促进细胞增殖[18]，这与文献报道的AF通过调节β-catenin的表达抑制人大肠癌细胞SW480增殖的结论相一致[19]。

Cyclin D1和p21，作为细胞周期调控的中枢，在Cyclin D1/CDK/CKI增殖信号通路中发挥着极为重要的作用，是G1期到S期过渡阶段的监测点[20-21]。细胞周期抑制蛋白p21可以抑制Cyclin D1的表达[22]，本文AF促进IH内皮细胞内p21的表达并显著抑制Cyclin D1的表达，导致细胞周期停滞在G1期，进而抑制了IH内皮细胞进一步增殖。Liu 等[23]证实AF通过ROS/AMPK/mTOR 信号通路抑制SKOV3 和OVCAR-3 卵巢癌细胞S 期激酶相关蛋白2(Skp2)的表达。李云霄等[24]证实AF可抑制结肠癌细胞增殖，本研究的结果与上述文献报道相一致，并进一步证实穗花杉双黄酮对肿瘤细胞的抑制作用。王曜晖等[25]证实AF可抑制3T3-L1细胞增殖并促进凋亡，可作为抑制细胞增殖的药物。本研究对IH内皮细胞的影响仅从周期和增殖方面进行研究，AF对IH内皮细胞的促凋亡作用尚未深入探究，下一步研究需要从增殖和凋亡两方面深入探究AF对IH内皮细胞的影响。

综上所述，AF可抑制IH内皮细胞增殖，其机制可能与抑制细胞内周期蛋白有关。这一研究结果为AF用于临床治疗IH提供了理论依据。