中兽医学大肠湿热泄泻模型的建立

张 亮

(甘肃畜牧工程职业技术学院，甘肃 武威733006)

携带一些特殊血清的大肠杆菌中可导致人和动物患病，常常引起婴儿和幼畜(禽)严重腹泻和败血症。中国药典2010版收录了一种名为番泻叶的泻下导滞药之一，番泻叶是由豆科植物狭叶番泻或者光叶番泻的干燥小叶组成。灌胃番泻叶可诱导大鼠体内的湿热毒素下行，经肠道排出体外，从而损伤大肠。因此，本实验是用高温高湿+大肠杆菌组，高温高湿+番泻叶组，高温高湿组等来模拟大鼠大肠湿热泄泻模型，观察大鼠的腹泻指数(稀便率+稀便指数)，临床表现(行为学、饮水量、采食量、体重、体温、尿量)来判断是否成功建立湿热泄泻模型，从三种方法中选择何种方法更适合用于建立中兽医大肠湿热证的模型，为进一步阐明大肠湿热证发病的病因、机理及其特点提供研究基础。

1 材料与仪器

1.1 实验药品和试剂

产毒性大肠杆菌标准株(菌号：44711)、蜂蜜水(20%)、白酒(二锅头56°)、猪油、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、盐酸、氢氧化钠、乙醇、生理盐水、新洁尔灭、蒸馏水。

1.2 实验仪器

KMD型调温电热套；多用真空泵(郑州)；RE-6000旋转蒸发仪； SHA-B恒温振荡器；KQ-300ED型数控超声清洗器；大鼠代谢笼；烘干箱；压力蒸汽灭菌器、恒温水浴锅注射器、试管架等。

2 实验设计与方法

2.1 高温仓的搭建

自制高温仓，模拟夏季高温高湿环境，温度范围(35±1℃)，湿度范围(85%～90%)。

2.2 番泻叶水煎液的制备

采购自兰州黄河药材市场的番泻叶样品称取400 g，加1200 mL蒸馏水浸泡和煮沸各1 h，取上清液，滤渣加蒸馏水600 mL，煮沸0.5 h，取上清液，合并两次上清液，过滤，用旋转蒸发仪浓缩至300 mL，然后用蒸馏水定容至400 mL，使其相当于含生药 1 g/mL，保存于4℃冰箱中备用。

2.3 培养基的制备

营养肉汤培养基制作：混合牛肉膏3 g、NaCl5 g、蛋白胨10 g。加热充分溶解于1 000 mL蒸馏水中，并分装于三角瓶中，调pH至7.2，121℃高压灭菌15 min，塞紧瓶塞，4℃冰箱贮存备用。

琼脂培养基制作：混合蛋白胨10 g，牛肉粉3 g，NaCl5 g和琼脂15 g，将混合物充分溶解于1 000 mL蒸馏水中，加热至完全溶解，分装至三角瓶中，并于121℃高压灭菌锅中灭菌15 min，在超净工作台倒板，4℃无菌保存备用。

2.4 大肠杆菌的培养

经过细菌复苏、平板筛选、传代培养使用麦氏比浊法测定大肠杆菌，并用生理盐水稀释浓度至1×109mol/L。

2.5 动物分组与造模

由甘肃中医学院动物实验中心提供的实验动物体重为160～180 g，雌雄 SD大鼠各20 只。用普通灭菌饲料饲喂大鼠，自由饮食和光照，保持温度为20～30℃，湿度40%～60%，3 d后进行实验。

采用完全随机分组法将大鼠分为空白组，高温高湿组，高温高湿+番泻叶组和高温高湿+大肠杆菌组。每组大鼠10只，其中雌鼠和雄鼠各5只。

空白组：饲喂普通饲料，自由饮食，自然光照

高温高湿模型组：单日饲喂普通饲料，双日禁食并对每只大鼠灌胃2mL猪油，每日给予足量的20%蜂蜜水。持续10 d；在第11天移入高温高湿仓(温度为35±1℃；相对湿度为85%～90%)内8 h，每日饲喂普通饲料，并给予足量的白开水，持续5 d，第16 天每只大鼠灌胃2 mL蒸馏水，24 h后重复一次。

高温高湿+番泻叶模型组：单日饲喂普通饲料，双日禁食并对每只大鼠灌胃2 mL猪油，每日给予足量的20%蜂蜜水。持续10 d；在第11天移入高温高湿仓(温度为35±1℃；相对湿度为85%～90%)内8 h，每日饲喂普通饲料，并给予足量的白开水，持续5 d，第16 天每只大鼠灌胃2 mL 0.05 g/mL的番泻叶水煎液，直到100%腹泻。

高温高湿+大肠杆菌模型组：单日饲喂普通饲料，双日禁食并对每只大鼠灌胃2 mL猪油，每日给予足量的20%蜂蜜水。持续10 d；在第11 天移入高温高湿仓(温度为35±1℃；相对湿度为85%～90%)内8 h，每日饲喂普通饲料，并给予足量的白开水，持续5 d，第16天每只大鼠腹腔注射0.3 mL浓度为1×109mol/L的大肠杆菌悬液，24 h后重复一次。

所有模型组和空白组大鼠在造模完成后，观察一天，并禁食不禁水24 h。

2.6 检测指标

2.6.1 大鼠行为观察 每日上午10点观察记录各组大鼠的精神状态、活动情况、皮毛光泽度、体温、食欲、粪便、饮水量、尿量、舌苔等。

2.6.2 大鼠采食量测量 在造模第1天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天、第15天、第16天和第17天分别测量各组大鼠的采食量。

2.6.3 大鼠饮水量测量 在造模第1天、第2天、第5天、第6天、第9天、第10天、第11天、第15天、第16天和第17天分别测量各组大鼠的饮水量。

2.6.4 大鼠体重测量 在造模前1天测量各组大鼠的空腹体重，并在造模第1天、第2天、第5天、第6天、第9天、第10天、第11天、第15天、第16天和第17天分别测量各组大鼠的体重。

2.6.5 大鼠尿量测量 在造模第1天、第2天、第5天、第6天、第9天、第10天、第11天、第15天、第16天和第17天分别测量各组大鼠的尿量。

2.6.6 大鼠体温(肛周)测量 每天下午4点分别测量造模前1天和造模第1天、第2天、第5天、第6天、第9天、第10天、第11天、第15天各组大鼠的肛周温度。在第16天和17天上午9点和下午4点各测一次肛温。

2.6.7 大鼠腹泻率和腹泻指数测量 模型组大鼠在腹腔注射大肠杆菌或灌胃番泻叶后每观察腹泻情况，并计算腹泻率和腹泻指数。

稀便率=每只动物的稀便次数/大便的总次数(稀便以滤纸上有无污迹为标准)；

腹泻指数=稀便率×稀便级。

稀便级别根据滤纸上污迹范围的大小分为4级∶1级污迹直径<1 cm；2级污迹直径1.0～1.9 cm；3级污迹直径2～3 cm；4级污迹直径>3 cm。

3 结果分析

3.1 大鼠行为观察

空白组大鼠一切行为正常。其它三组造模1～10 d内各模型组大鼠表现活跃，被毛光泽，食欲旺盛，尿量增多，表现为舌苔黄腻，个别大鼠出现鼻口红肿和出血症状。造模第11～15天各模型组大鼠出现体温升高，嗜睡，呆滞症状。表现为大鼠被毛杂乱无光泽，食欲和饮欲都有不同程度的降低，鼻口红肿和出血的大鼠比例明显增多，并出现粪便黏滞。在造模第16～17 d，大鼠精神更差，多数大鼠蜷卧一团，食欲和饮欲减少或废绝，尿量减少，多数出现溏便和黏液便，个别大鼠有血便。

3.2 大鼠体重变化

图1显示在整个造模过程中空白组大鼠体重升高明显，各模型组在高糖高脂阶段均有升高的趋势，但呈波浪式升高，可能与禁食有关，在高温高湿阶段，体重变化不明显，略有降低；在灌胃番泻叶和注射大肠杆菌后，这两个模型组大鼠体重有明显的下降，而高温高湿模型组体重有明显的上升。

图1 各组大鼠体重变化趋势折线图(x±s)

3.3 大鼠采食量变化

图2为各组大鼠采食量变化趋势图，造模前一天，各组大鼠禁食测量空腹体重，因此5.1日各组大鼠的采食量均有不同程度的升高，造模1～10 d内各模型组采食量变化不大，但均低于空白组，可能因为大鼠隔日禁食，脾胃损伤，导致采食量减少。高温高湿阶段各模型组大鼠采食量均有明显的下降，尤其番泻叶组和大肠杆菌组。

图2 各组大鼠采食量变化趋势折线图(x±s)

3.4 大鼠饮水量变化

图3各组大鼠饮水量变化趋势图，在高糖高脂阶段各模型组饮水量是明显升高的，呈波浪式升高，可能与禁食有关。在高温高湿阶段，饮水量急剧增加，可能与高温有关，在注射大肠杆菌和灌服番泻叶阶段，饮水量几乎呈现直线下降，尤其在5.16日以后比正常组均低，有可能是番泻叶的损伤肠道和大肠杆菌的致病作用，导致饮水量比正常组低。

图3 各组大鼠饮水量变化趋势折线图(x±s)

3.5 大鼠尿量变化

图4各组大鼠尿量量变化趋势图，在高糖高脂阶段各模型组尿量是明显升高的，呈波浪式升高，可能与禁食有关。在高温高湿阶段，体内水分散发较快，导致尿量减少，因此，可能与高温有关。注射大肠杆菌和灌服番泻叶，尿量减少，有可能是番泻叶的泻下作用导致大量的水分损失，和大肠杆菌致病是老鼠出现腹泻而丧失水分，因此尿量比正常组低。

图4 各组大鼠尿量变化趋势折线图(x±s)

3.6 大鼠体温变化

图5各组大鼠体温变化趋势图，在高糖高脂阶段，各模型组的体温均比正常组略高，所以此阶段无可比性。在高温高湿阶段，注射大肠杆菌和灌服番泻叶后，体温明显上升，番泻叶组将近比正常组高出0.5℃，大肠杆菌组比正常组高出1℃。可能是大肠杆菌造成了湿热主症。

图5 各组大鼠体温变化趋势折线图(x±s)

3.6 大鼠腹泻率和腹泻指数变化

大肠杆菌组在第一次注射大肠杆菌32 h后出现全部腹泻，腹泻率100%。番泻叶组在第一次灌胃番泻叶24 h后出现前部腹泻，腹泻率100%。

经上述分析后得出结果，本实验能成功建立湿热泄泻模型，而且大肠杆菌组最符合中兽医学临床特点的大肠湿热泄泻模型。

4 讨论

以生化学因素、症状、指标、中药复健治疗为主要依据的大肠湿热病证动物模型主要由外感暑湿、染疫疠之气、饲喂霉败秽浊或者有毒草料引发，以致损伤气血而发病。

以饮食、气候环境变化、大肠杆菌感染综合因素所形成的湿热泄泻模型比较理想，尤其是湿热证造模和大肠湿热模型。等研究。本人在前人的基础上，改良造模的方法，形成腹腔注射大肠杆菌配合饮食加环境复合法，复制大鼠大肠湿热泄泻模型，简单易行、造模时间短、成功率高、重复性好，自愈时间长，并选取了行为学观察，采食量、饮水量、尿量、体重、体温、腹泻率和腹泻指数的变化说明模型的可靠性。结果表明，各模型组与空白组比较进入高温高湿阶段从行为学观察各模型组大鼠虽然出现发热，嗜睡，呆滞症状。表现为大鼠被毛杂乱无光泽，食欲和饮欲都有不同程度的降低，鼻口红肿和出血的大鼠比例明显增多，并出现少量粪便粘滞。说明高温高湿不是引起大肠湿热证的主要原因。注射大肠杆菌和灌服番泻叶后大鼠精神更差，多数大鼠蜷卧一团，食欲和饮欲减少或废绝，尿量减少，多数出现溏便和粘液便，个别大鼠有血便。此外大鼠体重降低，采食量均有明显的下降，饮水量几乎呈现直线下降，尤其在灌服番泻叶和注射大肠杆菌以后比正常组均低，尿量呈现下降趋势均比正常组低，体温(大肠杆菌组)急剧上升，将近高达39℃。在从表1和表2中看出番泻叶组在24 h内腹泻率达到100%，大肠杆菌组在32 h内腹泻率达到100%，且腹泻指数与空白组比较都有有统计学意义(P<0.05)。因此大肠杆菌组是最符合湿热模型。由此证明本实验改良的造模方法是科学合理的。但是，本实验还存在许多不足之处，光凭临床症状及其一些体征变化及腹泻率和腹泻指数不一定判定为大肠湿热证，有时会混合感染其他疾病，应该还从肠道的病理变化做组织切片检查，还应该进一步检测生化指标、免疫因子、血常规等。

表1 各组所致湿热腹泻大鼠腹泻指数的情况(x±s)

表2 各组所致湿热腹泻大鼠腹泻指数的情况(x±s)