一起“阿什旦”育成牦公牛腹泻的病原学诊断及药敏实验

李春生 ,李吉叶 ,张国模 ,赵文军 ,马利青

(1.大通种牛场,青海 大通810102；2.青海畜牧兽医科学院兽医研究所)

“阿什旦”牦牛是以来自青海牦牛群体中性能优异，表型无角的公牦牛为父本，以青海大通种牛场分布的青海高原牦牛为母本，通过定向选育的一个生长发育快，产肉性能高，抗逆性强，适应高海拔地区规模化集约化饲养的肉用牦牛新品种。近年来青海大通种牛场有计划地采用建立育种核心群、强度淘汰、自群繁育、选育推广、推广验证等主要阶段，集成开放式核心群育种，分子辅助选择技术等现代先进育种技术，建立起了完善的四级繁育培育体系，青海大通种牛场现有“阿什旦”核心育种群12群.适繁“阿什旦”母牛 头，可推广“阿什旦”种公牛2群，400余头。2020年7月中旬，在夏季牧场的放牧的1.5岁“阿什旦”育成牦种公牛发生群体性腹泻，初发病时呈零星点状散发，病情于8月初起达到高峰，呈爆发式增长，累计共发病167头。临床症状表现为体温升高，精神沉郁，粪便呈灰白色、稀薄不成形并伴有恶臭味，排便呈喷射状。由于在野外，牛只不易抓捕，随机挑选有明显的临床症状的育成公牛18头，采用直肠采取粪便的方法，采取粪便18头/份。送检青海省畜牧兽医科学院兽医研究所进行化验。

1 实验材料

1.1 病料采集

在青海省大通种牛场疑似患畜中采集粪便18头，分别将粪便放入装有硫酸盐缓冲液的试管中，置于4℃冰壶保存。

1.2 培养基及试剂

革兰氏染色液，购自安徽省巢湖市弘慈医疗器械有限公司；营养肉汤、营养琼脂、麦康凯琼脂、血液琼脂培养基等，均购自青岛高科园海博生物技术有限公司；生化试验管、药敏片等，均购自杭州滨和微生物试剂有限公司。大肠杆菌、沙门氏菌PCR试剂盒(购自上海雅吉生物有限公司)。实验用小白鼠由青海省畜牧兽医科学院兽医研究所提供。

2 实验方法

2.1 细菌的分离纯化与镜检

将18份病料分别接种于血琼脂平板培养基上，37℃恒温培养24 h后观察(图1)。挑单个菌落，分别接种于麦康凯琼脂培养基上纯化培养，放入37℃恒温箱中培养24 h后观察结果。将纯化培养的细菌在载玻片上进行革兰氏染色，然后在显微镜下观察(图2)。

图2 革兰氏染色镜检图

2.2 致病性实验

将纯化后的细菌在营养肉汤中进行培养 24 h，而后将其腹腔注射昆明系小白鼠，每只 0.2 mL，注射 2 只，结果小白鼠于 24 h内死亡，且小鼠腹腔呈现肠道炎症症状详见图 3，说明该菌具有致病性，为致病性大肠杆菌。

图3 死亡小鼠症状

2.3 细菌生化鉴定

挑取单个菌落纯培养物分别接种到间肌醇、麦芽糖、甘露糖、海藻糖、丙二酸盐、L鼠李糖、D木糖、侧金盏花醇、乳糖、明胶、氧化酶、L阿拉伯糖、尿素酶、卫矛醇等生化管中37 ℃培养24 h后，观察结果并记录见表1

表1 大肠杆菌生化试验结果

2.4 沙门氏菌-PCR、病毒性腹泻(BVDV)RT-PCR、大肠杆菌16SrRNA-PCR实验

沙门氏菌-PCR检测具体操作步骤按试剂盒说明书进行。检测结果全部呈阴性。病毒性腹泻(BVDV)RT-PCR 检测具体操作步骤按试剂盒说明书进行。检测结果全部呈阴性大肠杆菌16SrRNA-PCR检测具体操作步骤按试剂盒说明书进行。经细菌 16S rRNA 鉴定，PCR 及测序，18份样品中编号为10#的样品分离菌株为大肠杆菌。见图4。

图4 细菌16srRNA PCR 结果图

2.5 药物敏感试验

本试验对分离菌株用 K-B 扩散法进行药敏试验，详细结果见表2。

表2 分离菌株(大肠杆菌)的药敏实验结果 mm,μg

2.6 虫卵检测

粪便经纯化，镜检，虫卵检测，18 份样品中有 14 份样品线虫阳性，详见图5。

图5 不同样品中检测到线虫虫卵

经细菌分离培养，在血平板培养基中生长出单一菌落，β溶血详见图 1。

图1 分离菌落形态

3 结果与讨论

经过病原学和寄生虫虫卵检测，得出此次造成育成牦公牛腹泻的病原学为多数牛感染了线虫和部分牛感染了致病性大肠杆菌。其次作者分析由于该病发生于8月中旬的高海拔夏季牧场，气温逐渐变冷加之阴冷多雨天气偏多，早晚温差加大。育成牛外感风寒，扭伤湿滞，加之牧草由青草期转为枯草期，成分与营养亦有一些变化，造成胃肠型感冒的现象也将存在。因此作者认为此次大规模腹泻疾病的发生是有生理性疾病和致病性微生物、寄生虫病三方面原因造成的，因此建议该种牛场更换驱虫药品，或将单一驱虫药物改换为两种或两种以上驱虫药物联合使用，以期达到良好驱虫效果。其次在夏季牧场放置营养舔砖或定期给育成牛灌服富含维生素和有机盐的营养物质，起到营养均衡，代谢正常。避免因营养单一而造成的腹泻现象发生。其次在条件容许的情况下，加大消毒工作。尽最大努力，避免致病微生物的侵袭。