雌激素浓度对大鼠髁突软骨细胞中雌激素受体表达的影响*

张娟 王江红 张帅 田利杰 王宝利 李长义

特发性髁突吸收（idiopathic condylar resorption，ICR）是一种特发于颞下颌关节软骨及软骨下骨的退行性病变，发病人群主要为15~35岁的青少年，尤其是青春期生长骤增期间［1］，男女比例约1∶9［2］。ICR主要临床症状包括下颌支发育短小、前牙开及面下1/3发育不足等，阻碍青少年的颌面部发育，影响青少年的身心健康。髁突作为下颌骨生长发育中心之一，当ICR发生时，髁突发育受抑制，关节软骨及软骨下骨可见破坏。锥形束CT（Cone beam Computer Tomography，CBCT）检查可见，髁突发生退行性变，骨皮质吸收不完整［3］，髁突垂直发育不良，表现为髁突高度降低，髁宽变小［4］，随着病情的进展，髁突形态改变会愈发明显［5］。从结构上看，髁突表面覆盖纤维软骨，软骨细胞不仅能表达Ⅱ型胶原蛋白保持软骨细胞的弹性功能，使髁突有足够能力缓冲外界给予的压应力；还有增殖、分化、骨化成骨的作用，促进下颌骨的生长发育。

人类流行病学调查及动物实验等证明，ICR的发生与雌激素水平异常密切相关［6，7］，雌激素浓度过高或过低均不利于软骨细胞的增殖分化，且雌激素对髁突软骨细胞的作用呈时间依赖性［8，9］，但目前未有研究得出有利于髁突软骨细胞增殖的确切雌激素浓度。基因及蛋白水平研究表明，雌激素受体（estrogen receptor，ER）α、β在髁突软骨细胞中表达，其中，ERα在髁突软骨的过渡层和肥大层表达较多，且分布于软骨细胞内，ERβ大多表达于髁突软骨的肥大层，且集中分布在软骨细胞的细胞核中［10］。雌激素在生理水平会上调髁突软骨细胞ERα表达，下调ERβ表达，在10-9mmol/L雌激素浓度下，E2最能上调ERα基因表达［11］。另有研究证明，当雌激素水平降低时，髁突软骨细胞中ERα、β的表达会同时下降［12］，但上述研究只是单方面证明雌激素浓度变化对某一基因表达的影响，且实验分组雌激素浓度变化跨度大。故本实验设计雌激素浓度变化跨度小，旨在探讨能促进髁突软骨细胞增殖的最佳雌激素浓度，以及雌激素浓度变化对ERs及Col II表达的影响。

1.材料与方法

1.1 材料4周龄雌性SD大鼠（斯贝福）、雌激素（MCE）、CCK-8试剂盒（MCE）、ERα抗体（Bio-oss）、ERβ抗体（ABclonal）、Col II抗体（Proteintech）。

1.2 提取原代髁突软骨细胞及细胞鉴定 获取4周龄雌性SD大鼠髁突软骨块，胰酶-胶原酶分步消化法提取髁突软骨细胞并进行细胞接种及原代培养，光学显微镜下观察提取细胞的形态，配置甲苯胺蓝工作液进行细胞鉴定：10%中性甲醛固定软骨细胞后，ddH2O冲洗，随后用甲苯胺蓝染色2h，置于显微镜下观察。

1.3 细胞生长曲线测定 据细胞培养时对细胞生长速度的观察，细胞增殖速度从第一代开始逐渐加快，传至第四代后逐渐减慢。当原代软骨细胞传至第三代时，待髁突软骨细胞达到70%~80%满底时，0.25%胰酶消化，后用含20% FBS的DMEM培养基终止消化并将其配制成密度为1×105个/mL的细胞悬液，接种于6孔板内，继续培养。培养24h后分别计数3孔的细胞数，每孔计数3次，取3孔细胞数的均值作为其计数时的细胞数。以后每隔24h分别计数3孔的细胞数，共计数7d，并绘制细胞生长曲线。

1.4 雌激素浓度改变对细胞增殖的影响 二甲基亚砜（DMSO）溶解雌激素，配制成不同浓度的雌激素溶液。当原代细胞传至第三代时，将细胞重悬、接种至96孔板中，37℃恒温箱中培养24h，细胞贴壁伸展后，进行不同干预。处理因素分为空白组（只含培养基）、对照组（软骨细胞无干预）、DMSO组、不同雌激素浓度干预组（10-12mol/L、10-11mol/L、10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L），其中DMSO组及不同雌激素浓度干预组所含DMSO浓度均为0.1%。干预24h后，快速加入CCK-8液10μL，37℃恒温箱孵育2h后，酶标仪测定其在450nm处的吸光度，根据公式计算软骨细胞增殖率。

细胞增殖率=（实验组-空白组）/（对照组-空白组）×100%

1.5 不同浓度雌激素干预及相关基因mRNA和蛋白检测 当原代软骨细胞传至第三代时，将细胞重悬、分别接种至24孔板和6孔板中，37℃恒温箱培养24h，待细胞贴壁伸展后，进行不同干预，处理因素分为对照组（软骨细胞无干预）、DMSO组、不同雌激素浓度干预组（10-12mol/L、10-11mol/L、10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L）。其中DMSO组及不同雌激素浓度干预组所含DMSO浓度均为0.1%。分别干预24h后，提取软骨细胞mRNA和蛋白，应用RT-PCR和WB技术检测ERα、ERβ、Col II基因和蛋白表达量的差异。应用image J软件分析ERα、ERβ、Col II蛋白条带的灰度值，先计算目的蛋白灰度值与对应分组β-actin蛋白灰度值的比值后，将对照组相对值设为1，计算相对表达量后形成柱状图。RT-PCR引物序列见表1。

表1 RT‐PCR引物序列

1.6 统计学分析 应用SPSS 23.0软件对所得数据进行统计学分析，所有实验均重复三次及以上，所得数据均用均数±标准差表示（xˉ±s）。组间比较采用t检验，当P＜0.05时认为组间存在显著性差异。

2.结果

2.1 细胞形态观察及细胞鉴定 提取髁突软骨细胞后，显微镜观察，刚接种的软骨细胞呈圆形，大约2h后贴壁，24h后，软骨细胞会伸出许多触角，形态呈多角形（图1）。此后，细胞密度逐渐增加，至7d左右长满培养皿底部。甲苯胺蓝染色可见胞质淡蓝染，胞核深蓝染。甲苯胺蓝染色结果证明提取的细胞是大鼠髁突软骨细胞。

图1 显微镜下髁突软骨细胞形态观察

2.2 测定细胞生长曲线 利用提取的原代软骨细胞测定细胞生长曲线，如图所示（图2），软骨细胞增殖在前两天处于平台期（P＞0.05）；从第2d进入对数生长期，至第5d生长逐渐缓慢。

图2 髁突软骨细胞生长曲线

2.3 雌激素浓度对软骨细胞增殖的影响CCK-8测定软骨细胞增殖率结果显示（图3），与DMSO组相比，10-10~10-7mol/L的雌激素能促进髁突软骨细胞增殖（P＜0.05），当雌激素浓度在10-9mol/L时，对软骨细胞促增殖作用优于其他组。以DMSO为溶剂不会影响髁突软骨细胞的增殖。

图3 CCK-8试剂盒测定髁突软骨细胞增殖率

2.4 雌激素浓度对软骨细胞基因表达影响

RT-PCR及WB结果表明，雌激素浓度变化对大鼠髁突软骨细胞不同基因的表达量会产生不同影响，DMSO组与对照组相比，DMSO的加入能促进ERα、β和Col II表达，所以实验组应与DMSO组进行比较，并做统计学分析。故与DMSO组相比较，雌激素对ERα及Col II的表达表现为促进作用，10-11~10-9mol/L的雌激素促进ERα的表达，10-9mol/L的雌激素对ERα的促表达作用优于其他组；当雌激素浓度为10-8~10-6mol/L时，能促进Col II的表达，10-7mol/L的雌激素对Col II表达的促进作用优于其他组；而10-10mol/L的雌激素会对ERβ的表达产生抑制作用（图4、5），以上结果均有统计学意义（P＜0.05）。如图6所示，ERα、ERβ、Col II蛋白表达的灰度值分析也得出如上结果。因此，10-8~10-7mol/L的雌激素既有利于髁突软骨细胞增殖，又能促进Col II表达。

图4 RT-PCR检测大鼠髁突软骨细胞ERα、ERβ、Col2 a1 mRNA表达

图6 ERα、ERβ、Col II蛋白表达的灰度值分析

10-10mol/L vs DMSOP=0.0002，10-9mol/L vs DMSOP＜0.0001，10-8mol/L vs DMSOP＜0.0001，10-7mol/L vs DMSOP=0.0036。

ERα：DMSO与conP=0.0019，10-11mol/L与DMSOP=0.0289，10-10mol/L与DMSOP=0.0270，10-9mol/L与DMSOP=0.0169；

ERβ：DMSO与conP=0.0056，10-10mol/L与DMSOP=0.0092，10-6mol/L与DMSOP=0.0138；

Col2a1：DMSO与conP=0.0112，10-8mol/L与DMSOP=0.0468，10-7mol/L与DMSOP=0.0014，10-6mol/L与DMSOP=0.0350。

图5 蛋白免疫印迹检测大鼠髁突软骨细胞ERα、ERβ、Col II蛋白的表达

3.结论

本实验利用胰酶-胶原酶联合消化法成功提取4周龄雌性SD大鼠髁突软骨细胞。并应用分组跨度较小的雌激素浓度分组来进行了软骨细胞增殖及相关基因表达测定的体外实验。实验证明，与对照组相比，10-9mol/L的雌激素对髁突软骨细胞增殖及ERα表达的促进作用优于其他组；10-7mol/L的雌激素对Col II的促表达作用优于其他组；而雌激素浓度的变化会对ERβ的表达产生抑制作用，10-10mol/L最为显著。雌激素促进髁突软骨细胞增殖和ERα、Col II基因表达，而在这些浓度下抑制ERβ基因和蛋白的表达。

4.讨论

本实验研究证明，与DMSO组相比，10-9mol/L的雌激素对髁突软骨细胞增殖和ERα基因的促表达作用优于其他组；10-7mol/L的雌激素对Col II表达的促进作用优于其他组；而雌激素浓度的变化会对ERβ的表达产生抑制作用，10-10mol/L最为显著。以往研究雌激素浓度分组跨度大，基本为10-12mol/L~10-6mol/L［11］或10-12mol/L~10-4mol/L［13］，本实验基于以往研究的雌激素浓度分组［11］，制定了一组雌激素浓度跨度较小的分组，进行更精确的实验研究。国内外均有学者证明，不论是在大关节包括膝关节或椎间盘，还是针对颞下颌关节髁突软骨细胞，正常生理浓度的雌激素对关节软骨及软骨细胞有保护作用，调控关节软骨细胞的生物学功能和基因表达［14-16］，雌激素浓度过高或过低均不利于软骨细胞的增殖［17-19］。但未有研究给出有利于软骨细胞增殖的确切雌激素浓度。基于本实验的雌激素浓度分组证明，10-9mol/L的雌激素最能促进软骨细胞的增殖，随着雌激素浓度的增高或降低，雌激素对软骨细胞增殖的促进作用逐渐减弱，这与以往研究结果相符。

雌激素主要通过ERα通道调节软骨形成、骨生长和生长板成熟［20，21］，关于基因表达的既往研究表明10-9mol/L的雌激素浓度最能促进SD大鼠髁突软骨细胞ERα的表达［11］，本实验与其结果一致。但在以往的研究中，雌激素浓度分组跨度大，不精确，且只测定了ERα mRNA的表达。从本实验RT-PCR结果可看出，10-11~10-9mol/L的雌激素能促进ERα基因的表达，10-9mol/L浓度的雌激素对ERα基因的促表达作用优于本实验其他分组，WB结果也表明，当雌激素浓度为10-11~10-9mol/L时，ERα蛋白表达量明显增加，10-9mol/L增加较其他组明显，且随着雌激素浓度的升高或降低，ERα mRNA及蛋白表达量逐渐减低，说明雌激素对ERα基因表达具有双向调节作用。

Col II是由软骨细胞产生的，主要存在于关节、骨骼和肌腱等组织中的有减震、缓冲作用的重要物质。正常水平的雌激素能促进Col II表达，10-7M剂量下的雌激素能最大限度地促进Ⅱ型胶原蛋白的表达［21］，本实验结果与其一致。但有实验证明，雌激素以时间和剂量依赖性方式通过ERβ通路抑制小鼠椎间盘生长板软骨细胞的增殖、分化，降低Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的表达，发挥抑制作用的最佳雌激素浓度为10-7/-6M［22］，即雌激素可通过ERβ通路调节Col II的表达，与本实验结果相反。本实验研究证明10-10mol/L的雌激素对ERβ具有抑制作用，而雌激素促进Col II表达时，对ERβ的促进作用并不明显，可能是由于上述实验研究的是小鼠椎间盘软骨细胞，而本实验为SD大鼠髁突软骨细胞，实验动物品系及研究部位不同，可见雌激素对不同品系的生命体软骨细胞的作用可能不同，故而对人髁突软骨细胞的研究更加迫在眉睫。

通过本实验研究证明，10-9mol/L的雌激素能促进大鼠髁突软骨细胞增殖和基因ERα表达，10-7mol/L浓度的雌激素能促进Col II表达，而雌激素对ERβ促进作用并不明显，并在10-10mol/L时抑制其表达。对于髁突软骨组织来说，ERs是雌激素作用于软骨细胞的经典核受体通路，Col II是软骨细胞产生的能够使软骨组织对抗外界压应力的主要物质，探索雌激素浓度变化对ERα、β及Col II基因表达影响的基础研究对于ICR的预防和治疗具有一定的临床意义。