利伐沙班对血管平滑肌细胞增殖迁移的影响

陈 杰 杨晓霞 余 汁

动脉硬化闭塞症(arteriosclerosis obliterans, ASO)是由动脉粥样硬化引起的缺血性疾病，其组织特征包括动脉内膜增厚、钙化和动脉管腔闭塞狭窄等[1, 2]。据报道，当前全世界约有2亿例ASO患者，其中，75岁以上人群的发生率高达20%[3, 4]。目前，已有大量研究探讨了ASO的潜在病理机制，涉及炎性反应、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的增殖迁移及血栓形成等，其中以VSMCs的异常增殖和迁移最为重要[5, 6]。作为血管壁的主要成分，VSMCs生物学功能的异常和表型转换可促进动脉粥样硬化、高血压和术后血管狭窄等血管疾病的发生，从而影响患者的生存质量[7, 8]。

利伐沙班是一种直接FⅩa因子抑制剂，相对分子质量较小(436g/mol)，可与血浆蛋白高度结合(结合率约为92%～95%)，具有口服便捷、见效快和高安全性等优点，故被广泛用于治疗冠状动脉疾病、术后静脉血栓和脑卒中等[9, 10]。利伐沙班的作用机制是浓度依赖性地抑制与凝血相关的FⅩa、与凝血酶原结合的FⅩa和游离FⅩa，但其对由凝血酶、胶原蛋白和二磷酸腺苷引起的血小板聚集无直接影响[9]。据报道，利伐沙班不仅能抑制血栓形成，减轻动脉粥样硬化斑块的进展和失稳，还能增强人脐静脉内皮细胞的活力和迁移，并保护这些细胞免受FⅩa因子的促炎作用[11, 12]。而关于利伐沙班对血管平滑肌细胞增殖和迁移的作用目前尚无研究阐明，本研究旨在探讨利伐沙班对PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞增殖及迁移的影响。

材料与方法

1.材料：人主动脉血管平滑肌细胞株(HAVSMC)购自美国ATCC公司；利伐沙班(美国Sigma公司)；Edu染色试剂盒(中国广州锐博生物技术有限公司)；FBS、PDGF-BB、抗N-cadherin、抗E-cadherin、抗GAPDH和兔抗IgG(中国上海碧云天生物技术有限公司)；RIPA裂解液和MTT试剂盒(中国北京索莱宝科技有限公司)；DMEM培养基(美国Gibco公司)； ECL化学发光试剂盒(中国上海翊圣生物科技有限公司)；PI/RNase染色液(美国Cell Signaling Technology公司)。

2.细胞培养：将HAVSMCs接种于含1%细胞生长因子、2%FBS、1%双抗(青霉素和链霉素)的DMEM培养基中，并培养于37℃、5%CO2的细胞培养箱中。待贴壁细胞密度达到80%时，用胰蛋白酶进行消化和传代，并选择3～7代处于对数期的稳定细胞用于后续实验。

3.细胞分组及处理：将HAVSMCs分成3组，即对照组、PDGF-BB组和PDGF-BB+利伐沙班组。待HAVSMCs细胞贴壁后，替换成无血清DMEM培养基孵育24h，使得HAVSMCs同步化。再给予20ng/ml PDGF-BB刺激HAVSMC细胞48h，以模拟ASO产生条件，促进血管平滑肌细胞发生增殖迁移。在此基础上，再用溶于DMSO的8μm利伐沙班与PDGF-BB诱导的HAVSMCs细胞共孵育24h。

4.MTT法检测各组HAVSMCs细胞活力：将HAVSMCs接种于96孔板，密度为5×104个/孔，而后置于培养箱中培养24h。按照材料与方法2进行不同细胞处理，离心并吸弃上清液，加20μl 5mg/ml MTT溶液反应3～4h。再加150μl DMSO试剂，振荡10min致使结晶充分溶解，酶标仪测570nm处的吸光度A值。

5.Edu染色法检测各组HAVSMCs增殖活性：将HAVSMCs接种于96孔板，密度为5×104个/孔，放入5% CO2培养箱中孵育24h。按照材料与方法2进行不同细胞处理，参考Edu染色试剂盒说明书，室温下在孔板中加50nmol/l Edu溶液继续培养细胞2h，加4%甲醛固定0.5h。而后，加入1000μl Edu Apollo处理细胞0.5h，DAPI核染色0.5h。用倒置显微镜(×100)观察染色情况，即时拍照。

6.流式细胞仪检测各组HAVSMCs细胞周期：分别转移1×106个对照组、PDGF-BB组和PDGF-BB+利伐沙班组的血管平滑肌细胞至流式管中，并用预冷PBS清洗2次。流式管经1100r/min离心后弃去上清，加5ml 75%乙醇，振荡混匀，并于4℃避光孵育过夜。1200r/min离心10min，小心移除上清。随后依次加入PBS和PI/RNase染色液，继续孵育12min，并在1h内用流式细胞仪检测G0/G1期、S期及G2/M期的细胞占比。

7.Transwell检测各组HAVSMCs迁移能力：收集对照组、PDGF-BB组和PDGF-BB+利伐沙班组的血管平滑肌细胞，将其悬浮于无血清培养基中，并稀释细胞悬液至2×106个/毫升。在Transwell小室的上腔室中加100μl细胞悬液，同时，下腔室中加500μl无血清DMEM培养基。37℃孵育24h后，用4%多聚甲醛固定，并用0.1%结晶紫溶液进行染色。最后，用倒置显微镜(×100)观察细胞迁移数并成像。

8.划痕实验检测各组HAVSMCs划痕愈合能力：收集对照组、PDGF-BB组和PDGF-BB+利伐沙班组的血管平滑肌细胞，将其接种于6孔板中，密度为1×105个/孔。待细胞贴壁后，再用无血清DMEM培养基培养12h。用20μl移液枪枪头在孔板上划线，同时用PBS清洗细胞2次。重新添加培养液，将孔板培养于37℃、5%CO2的培养箱，并于显微镜下(×40)观察0和24h的划痕变化及拍照。

9.Western blot法检测血管平滑肌细胞N-cadherin和E-cadherin蛋白表达：收集对照组、PDGF-BB组和PDGF-BB+利伐沙班组的血管平滑肌细胞，用RIPA裂解液提取细胞总蛋白。经SDS-PAGE分离目标蛋白，将其转移至PVDF膜上，加5%脱脂牛奶室温封闭膜2h。用PBST溶液漂洗PVDF膜5次，加入一抗并在4℃下孵育过夜：抗N-cadherin、抗E-cadherin(稀释比为1∶1000)和抗GAPDH(稀释比为1∶2000)。再次用PBST溶液漂洗，加入兔抗IgG(稀释比为1∶2000)孵育1h。以GAPDH为内参，用ECL化学发光试剂盒检测并分析各组目的蛋白表达量。

结 果

1.利伐沙班抑制PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞增殖：MTT及Edu实验显示，与阴性对照组比较，PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞活力明显升高(P<0.01)；与PDGF-BB组比较，利伐沙班处理显著抑制了PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞的活力(P<0.05，图1)。

图1 利伐沙班抑制PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞增殖A.MTT法检测各组HAVSMCs细胞活力；B.Edu染色观察各组HAVSMCs增殖情况(×100)；*P<0.05，**P<0.01

2.利伐沙班抑制PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞从G0/G1期到S期转换：PDGF-BB诱导的HAVSMCs中S期细胞数量较阴性对照组显著增加，且G0/G1期细胞比例明显下降；与PDGF-BB组比较，利伐沙班处理后，S期细胞数量明显减少，G0/G1期细胞比例明显升高，即利伐沙班抑制了PDGF-BB诱导的HAVSMC从G0/G1期到S期的细胞进程(图2)。

图2 流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期

3.利伐沙班抑制PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞迁移：与阴性对照组比较，PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞的迁移能力显著增强；与PDGF-BB组比较，利伐沙班处理能显著降低PDGF-BB诱导的HAVSMC的迁移能力，即利伐沙班在体外能有效抑制动脉硬化闭塞症模型细胞的迁移能力(图3)。

图3 利伐沙班抑制PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞迁移A.Transwell检测各组HAVSMCs的迁移能力(结晶紫染色，×100)；B.划痕实验检测各组HAVSMCs中划痕愈合情况(×40)

4.利伐沙班调控PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞迁移蛋白表达：与阴性对照组比较，PDGF-BB诱导的HAVSMCs中促迁移蛋白N-cadherin的表达量明显增加，但抑迁移蛋白E-cadherin表达量明显减少；与PDGF-BB组比较，利伐沙班处理PDGF-BB诱导的HAVSMCs后，N-cadherin表达量显著减少，E-cadherin表达量显著增加(图4)。

图4 Western blot法检测各组HAVSMCs中迁移相关蛋白N-cadherin和E-cadherin的表达量

讨 论

动脉硬化闭塞症是最常见的外周血管疾病之一，与高血压、年龄、慢性肾衰竭和糖尿病等高风险因素有关，可影响下肢动脉、冠状动脉和大脑动脉，且下肢动脉硬化闭塞症会增加静息疼痛、坏疽和跛行的风险[1,13,14]。在动脉硬化闭塞症的发生、发展过程中，脂质会持续沉积在动脉内膜上，促使其恶化增生，形成动脉粥样斑块[1]。且随着动脉壁的增厚和扭曲，斑块面积也会不断扩大，继而诱发血栓形成及缺血症状[15,16]。由于社会人口老龄化以及不健康的高脂饮食，动脉硬化闭塞症的发生率呈逐年上升趋势，现已引起广泛关注。

动脉硬化闭塞症的病理机制涉及血管平滑肌细胞的异常增殖迁移、炎性反应激活和动静脉血栓形成等，通常会导致患者机体供血不足，甚至危及其性命[6]。其中，血管平滑肌细胞的异常增殖迁移会致使血管腔狭小和管壁内膜增厚[17]，加速动脉硬化闭塞症的发病进程。据报道，miR-22-3p和miR-4463均可抑制血管平滑肌细胞的增殖迁移和内膜增生，从而调控动脉硬化闭塞症的病理进程[18,19]。通过查阅相关文献，笔者最终选用PDGF-BB刺激HAVSMCs，模拟动脉硬化闭塞症的产生条件，以构建体外细胞模型[5]。笔者研究表明，PDGF-BB诱导的HAVSMCs细胞活力显著升高，且S期细胞数量明显增加，处于活跃增殖状态。此外，HAVSMCs迁移能力明显增强，伴随着N-cadherin蛋白表达量上升，E-cadherin蛋白表达量下降，即PDGF-BB刺激处理促进了血管平滑肌细胞的异常增殖迁移。

迄今为止，动脉硬化闭塞症的诊断有了很大的提高，但其有效治疗措施仍然有限。目前动脉硬化闭塞症的治疗方式主要有开放性手术治疗、药物治疗及干细胞移植等。前者包括血管搭桥术、血管内治疗和动脉内膜切除术，但存在术后复发率高和仅有30%患者适用等弊端[4]。后者包括溶栓药、抗凝药、抗血小板药和血管扩张素等，但此类药物通常需要长期服用并存在各种毒性不良反应，如消化道出血、头痛等[20]。因此，筛选并采用不良反应小和低毒的新型抗凝药物有助于更好地治疗动脉硬化闭塞症患者。

利伐沙班作为全球第1个获得临床使用授权的新型口服抗凝药物，具有不良反应小、易吸收、抗血栓和抗炎功效，常被用于预防房颤血栓栓塞并发症、肺栓塞形成及术后静脉血栓栓塞形成[21～23]。据报道，利伐沙班可通过抑制FⅩa因子调控巨噬细胞和大鼠血管平滑肌细胞的炎症激活，从而减轻血管损伤后新生内膜的形成[24]。为了明确利伐沙班治疗动脉硬化闭塞症的药理作用，笔者研究用8μm利伐沙班处理PDGF-BB诱导的HAVSMCs，结果发现利伐沙班有效抑制了PDGF-BB诱导的HAVSMCs的细胞活力并抑制其由G0/G1期到S期，表现为S期的细胞数量明显减少。同时，利伐沙班处理PDGF-BB诱导的HAVSMCs后，血管平滑肌细胞的迁移能力也有所减弱，N-cadherin蛋白表达量减少，E-cadherin蛋白表达量增加，即利伐沙班能有效减弱血管平滑肌细胞的增殖及迁移能力，从而缓解动脉硬化闭塞症的发病症状。

综上所述，利伐沙班能有效抑制PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞增殖及迁移，为动脉硬化闭塞症的临床治疗提供一定的实验和理论基础。