高内涵技术检测葛根素对人源肥大心肌细胞BNP表达的影响

林育辉,周蕾,戴文军,黄炯华,何晓青

(广州医科大学附属第三医院心内科，广东 广州 510150)

高血压、缺血性心脏病、心脏瓣膜病等多种心脏疾病均可导致心肌细胞肥大。心肌肥大是心血管疾病死亡风险的一种独立预测因素。脑钠肽(brain natriμretic peptide，BNP)是一种具有生物活性多肽类物质，具有排出水钠的作用，主要由心肌细胞合成，特别是在心力衰竭时其分泌量明显增加。除了作为心衰标志物，BNP也是心肌肥大标志物之一，不仅反映左室收缩舒张功能障碍，也反映心肌肥大的情况。葛根素化学名为8-β-D-葡萄吡喃糖-4’,7-二羟基异黄酮，是从野生豆科匍匐茎葛根中分离出的主要异黄酮，具有多种药理活性，已用于治疗心肌梗死、高血压、心绞痛等心血管疾病[1]。本研究采用内皮素-1(endothelin-1，ET-1)诱导人源心肌细胞肥大模型，结合高内涵检测技术，旨在探讨葛根素能否通过降低BNP表达量，起到保护肥大心肌细胞的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

hiPSC诱导分化的人源心肌细胞(北京赛贝生物技术有限公司)、心肌细胞培养基(北京赛贝生物技术有限公司)、ET-1(美国Sigma公司)、葛根素(浙江震元制药有限公司)、Matrigel(美国BD公司)、Anti Cardiac Troponin T抗体(美国abcam公司)、Anti BNP抗体(美国abcam公司)。

1.2 实验仪器

高内涵仪器ImageXpress Nano(美国Molecμlar Devices公司)。

1.3 实验方法

1.3.1细胞培养与造模 Matrigel预包被96孔板，37 ℃放置30 min；复苏hiPS-CMs细胞，调整细胞浓度为1×105个/mL，每孔加入100 μL细胞悬液，37 ℃，5% CO2培养24 h；换液前将培养基水浴至37 ℃，吸取50 μL，弃去，加入100 μL心肌细胞培养基，37 ℃，5% CO2培养24 h；显微镜下观察细胞处于正常跳动状态后，全部更换心肌细胞培养基，每孔150 μL；细胞处理前6 h，更换培养基，每孔135 μL；葛根素使用培养基稀释为10×储备液，每孔加入15 μL，终浓度为200 μg /mL，37 ℃，5% CO2培养24 h；葛根素使用培养基稀释为1×工作液，采用此工作液配置10×ET-1储备液作为处理组，采用心肌细胞培养基配置10× ET-1储备液作为造模组，吸弃各孔中15 μL培养基，按实验设计加入药物处理各孔，37 ℃，5% CO2培养48 h。

1.3.2实验分组 分为5组：正常细胞组(CTL)：hIPSC-CMs不进行特殊处理；肥大心肌细胞组(ET-1)：10 nmol/L ET-1处理24 h ，以诱导hIPSC-CMs肥大；葛根素组(PI)：200 μg/mL葛根素处理 hIPSC-CMs 12 h；葛根素后处理组(ET-1+PI)：10 nmol/L ET-1诱导心肌肥大后，再加入葛根素200 μg/mL处理12 h；葛根素预处理组(PI+ET-1)：10 nmol/L ET-1诱导心肌肥大前，葛根素200 μg/mL预处理12 h。

1.3.3高内涵技术检测 弃去培养基，每孔150 μL预热PBS洗涤3遍；每孔50 μL 4%多聚甲醛室温固定30 min，弃去，PBS洗涤3遍；加入0.3% Triton-X 50 μL室温30 min，弃去，PBS洗涤3遍；加入5% BSA 50 μL置于振荡器上轻摇，室温封闭1 h，PBS洗涤3遍。1% BSA分别稀释一抗(BNP、TNNT2)1∶200，每孔加入50 μL，4 ℃过夜，第二天弃去，PBS洗涤3遍；加入1% BSA稀释二抗(1∶500)，每孔50 μL，置于振荡器上轻摇，室温避光孵育2 h，弃去，PBS洗涤3遍；加入PBS配置的Hoechst 33258(浓度10 μg/mL)，每孔50 μL，置于振荡器上轻摇，室温30 min，弃去，PBS洗涤3遍；加入PBS，每孔100 μL。

采用MD ImageXpress Nano高内涵仪器采集并分析数据。以DAPI通道(Hochest 33258，细胞核阳性)、FITC通道(TNNT2，心肌细胞阳性)为识别对象，统计视野内每个对象中Cy3通道(BNP)荧光强度，其平均值记为荧光强度，反映BNP表达量。DAPI为细胞核染色，各组心肌细胞胞核在荧光显微镜下可呈蓝色荧光，且TNNT2均为阳性反应，呈绿色荧光；而BNP呈红色荧光，Merge为合成图。

1.4 统计学方法

2 结 果

各组免疫荧光染色图像见图1。各组高内涵荧光强度统计分析见图2。由统计结果可以看出，ET-1处理心肌细胞后，心肌细胞肥大导致BNP的表达量增加。与ET-1组相比，各组BNP表达量均减少(P< 0.05)，其中PI+ET-1组、ET-1+PI组BNP表达量较ET-1组明显下降(P< 0.05)，这说明葛根素的预处理及后处理均可降低肥大心肌细胞BNP的表达量，其中葛根素预处理组(PI+ET-1组)下降更为明显(P< 0.05)。

CTLPIET1PI+ET-1ET-1+PI

250200150100500Intensity**********CTLPIET-1PI+ET-1ET-1+PIGroups

3 讨 论

心肌肥大是心肌细胞对压力超负荷及神经内分泌因子等刺激因素所做出的代偿性反应。多种心血管疾病可导致心肌肥大，包括高血压、心脏瓣膜病、肥厚性心肌病、冠心病等[2]。从细胞水平来说，肥大刺激信号与心肌细胞上的特定受体或者膜通道结合，经胞内细胞信号通路的传导，可将刺激信号传递到细胞核，引起基因转录的改变及蛋白表达的变化，最终导致心肌细胞出现肥大的表型及功能障碍等一系列病理变化[3]。若肥大刺激因素不消除，肥大心肌细胞会从代偿向失代偿转变，最后进入心力衰竭阶段[4]。β受体阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂等在临床上虽然取得一定的疗效，但其应用仍有很大的局限性。寻找有效治疗心肌肥大的药物，对于降低此类患者的住院率及死亡率具有十分重要的意义。

ET-1是由平滑肌细胞、心肌细胞或血管内皮细胞等合成及分泌的一种含有21个氨基酸的活性多肽；主要以旁分泌的形式作用于细胞表面的ET受体[5]。ET受体是G蛋白偶联受体，ET-1与位于细胞膜上的ET受体结合后，除了起着强效缩血管效应，对循环系统功能的调节也起着重要的作用。局部组织中ET-1过表达与心肌细胞肥大的发生发展关系密切，可通过激活PKC、MAPK、Ca2+等多条信号通路介导心肌肥大的病理生理过程[6-7]。本实验采用ET-1诱导心肌细胞肥大，模拟人体病理状态下心肌局部ET-1浓度升高的病理过程。这种肥大心肌细胞模型较为接近机体心肌肥大的病理状态，是药物试验的理想模型工具。在前期实验中，我们已经证实ET-1可诱导人源心肌细胞肥大，成功制作肥大心肌细胞模型[8]。

葛根素是从豆科植物野葛根中提取的一种单一成分黄酮苷[9]，具有多种药理特性，包括降低血压、减慢心率、降低心肌耗氧量、扩张冠状动脉、改善微循环、改善心肌细胞代谢、抑制动脉硬化、抗心律失常及β受体阻滞和血管紧张素转化酶抑制等作用[1]。已有研究结果证实，葛根素能抑制心肌肥大[10]。本课题组前期实验结果表明，葛根素对于心肌细胞安全的血液浓度范围较大，200 μg/mL为临床报道4 h血药浓度的10倍，该浓度下没有表现出对hiPS-CMs的细胞毒性和心肌毒性，故本研究将该浓度定为研究葛根素对心肌细胞实验研究的作用浓度[8]。

BNP是由心肌细胞合成的，具有生物学活性的天然激素，其合成分泌的主要部位是心室，同时也存在于脑组织中。多种因素可影响BNP的释放，容量负荷引起的心室压力改变及室壁张力的增加可有效刺激BNP的释放[11]。机体健康状态下，BNP的表达量很少，但在心肌肥大或心力衰竭时，BNP的表达量会明显增加[12]。

国内外研究证实，ET-1可以促进心脏合成、分泌BNP。ET-1与位于细胞膜上的ET受体结合后，通过PKC、MAPK、Ca2+等信号通路，增加转录因子的磷酸化调节基因的表达,促进心肌细胞肥大，包括α-actinin、BNP等多种蛋白表达增加。ET-1促进心肌细胞分泌BNP的具体机制如下：ET-1与心肌细胞上的ET受体相结合，通过上述信号转导通路，细胞内Fos、Jμn、Egr-1、c-myc表达水平增加，进而导致BNP的合成及分泌增加[6,13-14]。当然，ET-1促进BNP表达增加是否还有其他信号通路的参与，哪条信号通路起着最主要的作用，仍有待进一步深入研究证实。

高内涵检测技术可通过高分辨率的荧光成像系统对活细胞进行快速、灵敏、多参数的细胞生物学信息采集，并可通过相应软件进行统计分析，其最大优点就是能够在保持细胞结构完整及功能相对正常的情况下，多靶点多通道检测活细胞的各项生物学功能[15]。对于心肌细胞这种贴壁细胞，HSC技术的自动显微成像技术与图像分析技术相结合，可对贴壁心肌细胞多个细胞成分进行多靶点检测，具有速度快、准确率高并且可以量化的优势。

本研究采用96孔板接种人源心肌细胞，并用ET-1诱导肥大，以DAPI通道(细胞核阳性)、FITC通道(TNNT2，心肌细胞阳性)为识别对象，统计视野内每个对象中Cy3通道(BNP)荧光强度，其平均值记为荧光强度，反映BNP表达量。本实验结果表明，ET-1诱导hIPSC-CMs肥大后，BNP表达量明显增加；葛根素预处理或后处理，均可降低肥大心肌细胞BNP的表达量。本研究中采用的高内涵检测技术从图像扫描到数据分析时间控制在2 h以内，与传统的免疫组化方法相比较，实验时间明显减少、实验效率显著提高。另外，本实验采用人源性心肌细胞作为目标细胞，这种人源心肌细胞与人体原有心肌细胞无论在基因序列，还是在细胞结构及功能上保持高度一致，并具有自发性节律性搏动功能，在探索研究某些药物对人心肌细胞的功效、毒性及作用机制方面具有重要的意义，实验所得到的结果更接近临床实际。