金莲花总黄酮对高糖诱导下HEPG2细胞功能的影响

樊锐锋 李 威 刘 艳 李洪涛

长期维持在高水平的血糖对人体肝脏功能有严重的影响，极易引发非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)[1]。NAFLD是指除酒精等明确因素所致，以肝实质细胞脂肪变性和肝小叶内炎症为特征的临床病理综合征[2,3]。其发病机制包括二次打击学说、多重打击学说(胰岛素抵抗、细胞凋亡、氧化应激)、肠道微生态紊乱、自噬等多种理论[4～6]；其中脂类蓄积、氧化应激和胰岛素抵抗这几个方面与NAFLD的发病密切相关[7,8]。近年来应用具有较好抗氧化、抗炎药效的中药治疗NAFLD成为研究热点，黄酮类物质在临床研究中被证实对NAFLD有较好的临床疗效[9,10]。因此，笔者推测黄酮类物质含量较高的中药金莲花也可能通过其抗氧化作用对肝细胞的氧化应激起到调节作用[11,12]。

金莲花为毛茛科植物金莲花(trollius chinensis bunge)的干燥花，为我国传统中药，研究表明总黄酮类为其主要有效成分，具有抗氧化、消炎、抑菌和抗病毒等多种药效[13,14]。依赖于金莲花较好的抗氧化作用，推测金莲花总黄酮提取物对高血糖造成的肝细胞功能异常有一定的治疗作用[15]。本研究采用培养HEPG2细胞，通过观察添加高浓度葡萄糖和不同剂量的金莲花总黄酮后，细胞在脂代谢能力和氧化应激水平等方面的变化来验证金莲花总黄酮的作用效果和调节机制，为临床应用此类药物预防及治疗肝细胞损伤提供数据支持。

材料与方法

1.材料：(1)HEPG2细胞系:购自上海继和生物科技有限公司(JH-H1219)，按要求培养、传代，用于后续研究。(2)提取物：金莲花总黄酮提取方法：金莲花购自黑龙江省呼玛县，经黑龙江中医药大学孙慧峰教授鉴定为毛茛科植物金莲花的干燥花。取金莲花药材粉碎后过80目筛，所得金莲花粉末，加入65%乙醇(物料比1∶20)恒温超声波提取(温度60℃，功率600W，提取时间9min)。减压浓缩样品液，上大孔树脂柱，先用水、10%乙醇洗脱后，用75%乙醇洗脱，浓缩蒸干，将干膏溶解于蒸馏水，再用乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，减压浓缩合并两部分浸膏得到精制总黄酮浸膏，低温烘干得总黄酮粉末。(3)药品及试剂：葡萄糖(美国Sigma公司，G8270-100G)、油酸钠(美国Sigma公司，662569-10G)、尼罗红(美国Sigma公司，72485-100MG)、SREBP-1C(英国Abcam公司，ab3259)、FAS(英国Abcam公司，ab133619)、SCD(英国Abcam公司，ab257658)、CPT-1(英国Abcam公司，ab189182)、ACTINβ(美国Santa Cruz公司，sc-70319)、细胞活性氧检测试剂盒(中国碧云天公司，S0033S)。

2.葡萄糖和金莲花总黄酮作用浓度的确定：预实验使用96孔板培养HEPG2细胞，分别加入0、6、12、25、50、100mmol/L的葡萄糖，剩余细胞分别加入0、10、20、40、80、160μmol/L的金莲花总黄酮，CCK8法检测不同浓度葡萄糖或金莲花总黄酮作用24h后细胞活力变化，计算得到葡萄糖培养HEPG2细胞24h的IC50值为90.24mmol/L；金莲花总黄酮培养HEPG2细胞24h的IC50值为125.1μmol/L。参照Zhang等[16]对高浓度葡萄糖诱导HEPG2细胞的研究，本研究使用终浓度25mmol/L的葡萄糖对细胞进行诱导。为了在不影响细胞正常生长的情况下研究金莲花总黄酮的药效机制，实验中以30% IC50浓度作为金莲花总黄酮的最高作用浓度。

3.实验分组：培养的HEPG2细胞随机分成对照组、模型组、低剂量组、中剂量组及高剂量组[14]。除对照组外，均加入终浓度为25mmol/L的葡萄糖；模型组不加入金莲花总黄酮，低剂量组、中剂量组及高剂量组还分别加入终浓度分别为10μmol/L(7.5% IC50)、20μmol/L(15% IC50)和40μmol/L(30% IC50)的金莲花总黄酮，培养24h后收集细胞。

4.脂肪代谢能力检测：将油酸钠(200μmol/L)加入培养液中，培养24h后，采用尼罗红(0.5μg/ml)染色30min，其中一部分细胞经Hochest33342染色后于荧光显微镜下拍照(590nm)；流式细胞仪检测剩余细胞的红色荧光强度(590nm)。

5.活性氧簇水平检测：采用DCFH-DA法，各组培养后加入0.5ml DCFH-DA探针(10μmol/L)，37℃避光孵育30min，其中一部分细胞经Hochest33342染色后于荧光显微镜下拍照(530nm绿色荧光强度)；流式细胞仪检测剩余细胞的荧光强度(525nm)。

6.mRNA的相对表达水平检测：抽提细胞内总RNA(Trizol法)，反转录后，SYBR Green染料法及LC480实时定量荧光PCR仪进行扩增，目标基因引物序列详见表1，2-△△CT法计算mRNA的相对表达水平。

表1 引物序列

7.蛋白表达水平检测：采用Western blot法，加入相应抗体使抗原抗体结合，之后加入ECL进行放射自显影检测，用Image J图像分析软件对条带的灰度值进行分析。

结 果

1.金莲花总黄酮对脂肪代谢功能的影响：模型组细胞在葡萄糖的诱导下，脂类物质明显蓄积(对照组3678.00±186.95 vs 模型组27822.00±1721.32，P<0.01)，而在添加金莲花总黄酮后，这种蓄积情况有所改善，且随着金莲花总黄酮添加浓度的逐渐增加，效果越发明显，在高剂量组中的表现已经与对照组差别不大(高剂量组4905.00±165.61，P<0.01)；流式细胞峰值图的结果也表明，金莲花总黄酮降低了尼罗红染色后高浓度葡萄糖诱导下的HEPG2细胞中红色荧光的强度。实验结果证明金莲花总黄酮对于高浓度葡萄糖诱导的脂肪蓄积有明显的改善作用，且呈现出一定的剂量依赖的特点(图1)。

图1 各组脂肪代谢水平及流式细胞峰值图(尼罗红染色，×40)

2.金莲花总黄酮对脂肪代谢相关因子表达水平的影响：本实验选择了脂类代谢相关的胆固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)、脂肪酸合成酶(FAS)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)和肉毒碱棕榈酰基转移酶(CPT1)作为检测目标。模型组中细胞在高浓度葡萄糖诱导后，SREBP-1及FAS的mRNA表达水平显著升高，而SCD和 CPT1的mRNA表达水平显著降低，而金莲花总黄酮的添加改善了相关因子表达水平的变化，在中、高剂量组中表现的极为显著，具有一定的剂量依赖趋势(图2)。蛋白印迹的结果也显示出同样的趋势，但在FAS的蛋白表达水平的实验结果中，金莲花总黄酮浓度的变化并未显示出趋势性差异(图3、图4)。上述结果表明，金莲花总黄酮可以通过调节脂肪代谢的相关因子来减轻脂肪蓄积水平。

图2 脂代谢关键因子mRNA表达水平检测与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01

图3 关键因子蛋白表达水平检测

图4 蛋白表达水平灰度分析与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01

3.金莲花总黄酮对HEPG2细胞ROS水平的影响：肝细胞内氧化应激水平及活性氧簇(ROS)的代谢平衡与细胞内的脂肪蓄积密切相关。ROS进行的检测结果表明，模型组细胞在葡萄糖的诱导下，ROS水平明显升高，而金莲花总黄酮的添加显著降低了细胞中的ROS水平，流式细胞峰值图也表现出同样的变化趋势(图5)。对超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽还原酶(GSR)及过氧化氢酶(CAT)的mRNA表达水平的实验结果表明，金莲花总黄酮的添加改善了高浓度葡萄糖引起的SOD、GSR和CAT的mRNA表达水平的降低，且在SOD和GSR的mRNA表达水平的结果中表现出一定的剂量依赖的特点(图6)。上述结果表明，金莲花总黄酮可以通过调节氧化应激的关键因子的表达来降低ROS水平，金莲花总黄酮的抗氧化性对于改善ROS水平有一定作用。

图5 体外培养HEPG2细胞内ROS水平检测结果及流式细胞直方图(DCFH-DA染色，×100)

图6 细胞内抗氧化因子mRNA表达水平与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01

讨 论

近年来，NAFLD在中国发生率高达29.2%，且呈逐年增加趋势，并出现低龄化趋势，严重威胁人民健康[17]。NAFLD与脂肪代谢异常和氧化应激均有密切关系[18, 19]。本研究结果表明，高浓度葡萄糖诱导引起HEPG2细胞的脂肪蓄积，而脂肪的不断蓄积提高了ROS水平，这符合关于NAFLD的“二次打击学说”，肝脏是ROS攻击的主要器官之一，肝脏当中的实质细胞最容易受氧化应激诱导损伤，而脂肪蓄积是引起ROS水平提高的重要原因[20]。

金莲花做茶饮古籍中就有记载，“谓作常茶饮，可以消灾延寿”，可见金莲花的保健作用早已得到关注[21]。结果表明，金莲花总黄酮能够降低体外培养细胞内的脂类物质积累，并显著降低脂类物质积累所造成的肝细胞内ROS 水平的异常升高，并进一步证实这种作用是通过调节细胞内脂类代谢相关因子(SREBP-1、FAS、SCD和CPT1)和抗氧化因子(SOD、GSR和CAT)的表达水平来实现的，这可作为金莲花做茶饮具有保健效果的依据，也对于NAFLD的早期预防和治疗具有非常重要的意义。

目前国内外多项研究证实，从桑叶和柑橘等中药材中提取的黄酮类成分对NAFLD有较好的疗效，本研究结果也证实金莲花总黄酮对高浓度葡萄糖诱导下的HEPG2细胞所产生的氧化应激损伤和脂类代谢的异常有一定的抑制作用[22,23]。中药金莲花有效成分以黄酮类化学成分为主，约占金莲花干质量的18%，主要包括荭草素、牡荆素、异当药黄素、槲皮素、异槲皮素、金莲花碳苷Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ及其衍生物等，金莲花中各种黄酮类成分对于NAFLD的药效和作用机制还有待于进一步研究验证[24]。

本研究通过高浓度葡萄糖的诱导培养使HEPG2细胞表现出非酒精性脂肪肝的病症，脂肪蓄积，ROS水平升高。金莲花总黄酮的添加能够缓解脂肪蓄积，降低ROS水平，且表现出一定的剂量依赖的特点，为进一步研究金莲花总黄酮中成分治疗非酒精性脂肪肝和金莲花相关药品及保健产品的开发提供理论依据。