lncRNA VIM-AS1靶向miR-126-5p调控肺癌细胞放射敏感性分子机制研究

马莉莎 王嵘 柴丽霞

肺癌(lung cancer)是世界上发病率最高的癌症，患者5年生存率<15%，放疗是其重要治疗手段之一，患者后期产生的放射耐受是影响临床治疗效果的主要原因之一[1,2]。越来越多的研究证实，lncRNA(long non-coding RNA)和miRNA(micro RNA)在肺癌组织、细胞或体液中表达异常，通过EMT等途径参与肺癌的发生发展、放化疗耐受、预后及靶向治疗等[3-5]。报道显示，lncRNA VIM-AS1(VIM antisense RNA 1，VIM-AS1) 在前列腺癌和结直肠癌中高表达，下调其表达可抑制癌细胞的增殖等过程[6,7]。本研究通过startBase预测发现，miR-126-5p可能是VIM-AS1的靶基因。miR-126-5p在肺腺癌组织和患者外周血中含量降低，与患者预后有关[8]。细胞凋亡是放疗诱导肿瘤细胞死亡的主要机制，细胞凋亡的增加利于增强放疗敏感性[9]。而VIM-AS1和miR-126-5p在提高肺癌放射敏感性中的作用及相互关系目前尚不清楚。本课题主要研究lncRNA VIM-AS1对A549细胞放射敏感性的影响，以及miR-126-5p在其中的作用，为肺癌临床放疗敏感性研究提供新的数据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 人正常肺上皮细胞BEAS-2B及人肺癌细胞A549、SPCA1和HCI-H596细胞购自中科院上海细胞库；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司，牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)、胰蛋白酶Trypsin购自Sigma-Aldrich公司；双荧光素酶报告系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System)购自美国Promega公司；引物、miR-126-5p mimics(miR-126-5p)、miR-126-5p抑制剂(anti-miR-126-5p)、VIM-AS1干扰物(si-VIM-AS1)、空载体和对照物(miR-con、anti-NC和si-NC)及VIM-AS1突变型和野生型双荧光素酶载体购自上海吉玛制药技术有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂、Total RNA提取试剂盒、real-time PCR 试剂盒、反转录试剂盒(RT-PCR)购自宝生物工程(大连)有限公司；Real-time PCR仪购自美国Bio-Rad公司；BCA蛋白试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:将人正常肺上皮细胞BEAS-2B及人肺癌细胞A549、SPCA1和HCI-H596培养在含10% FBS的DMEM高糖培养液(添加100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素)中，37℃ 5% CO2培养箱中培养，湿度95%，将细胞培养至对数生长期，消化传代。

1.2.2 细胞转染:收集对数生长期的A549细胞，用培养液将细胞稀释至1×106个/ml，以200 μl细胞/孔的密度接种于6孔板中，细胞培养至基本融合为一层时进行转染。根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行转染操作，将不同的载体转染入培养好的A549细胞中，培养6 h后换成DMEM高糖完全培养基，转染48 h后收集细胞进行实验。根据转染载体进行分组：si-NC组和si-VIM-AS1组、miR-con组和miR-126-5p组、si-VIM-AS1+anti-NC组和si-VIM-AS1+anti-miR-126-5p组。qRT-PCR检测VIM-AS1和miR-126-5p的表达收集培养好的BEAS-2B、A549、SPC A1和HCI-H596细胞，用试剂盒提取细胞总RNA，测定浓度和纯度，然后按照反转录试剂盒说明书合成cDNA，以cDNA为模板按照 real-time PCR的说明书进行反应合成miR-126-5p和VIM-AS1，反应程序为：95℃ 2 min；95℃ 15 s、55℃ 40 s、72℃ 30 s，35个循环，用2-ΔΔCt方法进行数据分析。

1.2.3 克隆形成实验：测定放射处理后细胞存活分数收集转染后的对数生长期各组A549细胞，消化并计数，然后接种于6孔板，过夜培养。然后将细胞暴露于不同辐射剂量下(0、2、4、6、8 Gy)进行照射处理。辐射处理后细胞以500个/皿接种于细胞培养皿中，加入10 ml培养液混匀，培养10～14 d至出现肉眼清晰可见的细胞克隆，洗涤细胞2次，甲醛固定细胞，结晶紫染色，计数，细胞克隆数>50个为有效。根据单击多靶模型拟合细胞存活曲线，计算放射增敏比(SER)。细胞克隆形成率 = (克隆数平均值/铺板细胞总数)×100%，细胞存活分数(survival fraction,SF) = 受照射细胞克隆形成率/对照细胞克隆形成率)×100%。

1.3 流式细胞术测定细胞凋亡率 手机转染和(或)放射处理后培养48 h的各组A549细胞，接种于6孔板，培养72 h后弃去培养液，洗涤细胞并胰酶消化，离心收集细胞，按照 Annexin V/PI 凋亡试剂盒说明书进行操作，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.4 双荧光素酶报告实验 按照方法1.2.2培养A549细胞和转染，分别将构建好的VIM-AS1的野生型(WT-VIM-AS1)和突变型(MUT-VIM-AS1)双荧光素酶报告载体与miR-con或miR-126-5p共转染A549细胞，转染后培养48 h，收集细胞，将细胞裂解，离心收集裂解上清。发光仪检测荧光素酶活性，以海肾荧光素酶活性为内参照，计算相对萤火虫荧光素酶活性。

2 结果

2.1 肺癌细胞中VIM-AS1高表达miR-126-5p低表达 与正常肺上皮细胞BEAS-2B组比较，肺癌细胞A549、SPC A1和HCI-H596组中VIM-AS1含量均显著升高(P<0.05)，miR-126-5p的含量均显著降低(P<0.05)。根据实验结果，选择A549进行后续实验。见表1。

表1 VIM-AS1 和miR-126-5p 在肺癌细胞中的表达

2.2 沉默VIM-AS1对肺癌细胞A549的放射敏感性的影响 沉默lncRNA VIM-AS1后，克隆形成实验结果表明，随着照射剂量的增加，与si-NC组比较，si-VIM-AS1组A549的细胞存活分数逐渐下降，且差异有统计学意义(P<0.05)，放射增敏比为1.776。选择具有显著差异且对细胞伤害小的照射剂量2Gy进行后续实验。见表2、3，图1。

表2 沉默VIM-AS1 对A549 细胞的存活分数(% )的影响

表3 沉默VIM-AS1 后单击多靶模型的参数值

图1 沉默VIM-AS1对肺癌细胞A549的放射敏感性的影响

2.3 沉默VIM-AS1对辐射照射诱导的A549细胞凋亡的影响 与Control组和si-NC组比较，2 Gy处理后，si-VIM-AS1组的肺癌A549细胞凋亡率显著上升(P<0.05)；与Control+Gy和si-NC+Gy组比较，si-VIM-AS1+Gy组A549细胞凋亡率也显著升高(P<0.05)。表明沉默VIM-AS1可增加肺癌A549细胞的放射敏感性并促进细胞凋亡。见图2，表4。

图2 沉默VIM-AS1对2 Gy辐射处理后HCT116细胞凋亡的影响

2.4 VIM-AS1负调控miR-126-5p的表达 startBase预测结果显示，miR-126-5p的序列中含有与VIM-AS1互补的核苷酸位点。双荧光素酶报告显示，与miR-con组比较，过表达miR-126-5p可下调野生型WT-

表4 沉默VIM-AS1 后6 组A549 细胞的凋亡率

VIM-AS1的萤火虫荧光素酶相对活性(P<0.05)；而突变型MUT-VIM-AS1的萤火虫荧光素酶相对活性没有明显变化。qRT-PCR结果显示，下调VIM-AS1表达可上调miR-126-5p含量(P<0.05)。说明VIM-AS1靶向负调控miR-126-5p的表达。见图3，表5、6。

图3 VIM-AS1与miR-126-5p互补结合的核苷酸位点

表5 双荧光素酶试验验证VIM-AS1 与miR-126-5p 靶向结合

表6 lncRNA VIM-AS1 负调控miR-126-5p 的表达

2.5 VIM-AS1对miR-126-5p调控结肺癌细胞A549的放射敏感性的影响 为确认lncRNA VIM-AS1调控miR-126-5p，在沉默VIM-AS1的同时抑制miR-126-5p，结果表明，2Gy放射处理后，与si-VIM-AS1+anti-NC组比较，si-VIM-AS1+ anti-miR-126-5p+Gy组的A549细胞存活分数显著升高(P<0.05)，细胞增敏比为0.598，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，与2.2和2.3结果相反。说明抑制miR-126-5p表达可逆转沉默VIM-AS1对A549细胞放射敏感性和凋亡的作用。见表7、8，图4、5。

表7 抑制miR-126-5p 逆转了沉默VIM-AS1 对A549细胞放射敏感性的影响

表8 抑制miR-126-5p 联合沉默VIM-AS1 后单击多靶模型的参数值

图4 沉默VIM-AS1增加肺癌细胞A549的放射敏感性

图5 抑制miR-126-5p逆转了沉默VIM-AS1对辐射照射A549细胞凋亡率的影响

3 讨论

多项研究表明，lncRNA可通过miRNA在肺癌的放射敏感性中发挥重要作用[10-12]。有研究发现，lncRNA VIM-AS1在前列腺癌中通过EMT调控癌细胞的增殖和侵袭[6]，lncRNA VIM-AS1还通过EMT促进结直肠癌的进展和转移[7]。lncRNA VIM-AS1在2型糖尿病和子痫前期也发挥重要作用[13,14]，但其在肺癌细胞中的表达及其对肺癌放射敏感性的作用尚不清楚。本研究结果表明，VIM-AS1在肺癌细胞A549、SPC A1和HCI-H596中含量均显著升高，不同放射剂量(0、2、4、6、8 Gy)处理A549细胞，细胞存活分数逐渐下降，用影响较小的2 Gy处理A549细胞，细胞凋亡率也显著升高，放射增敏比为1.776，说明沉默VIM-AS1可增强A549细胞放射敏感性并促进其凋亡，从而抑制肺癌细胞生长。

此外，本研究通过startbase预测发现，miR-126-5p与VIM-AS1存在结合位点，其可能是VIM-AS1的靶基因。因此，本研究假设VIM-AS1通过靶向miR-126-5p影响肺癌细胞的放射敏感性。miR-126-5p是miR-126的成熟形式，位于第9号染色体，是来源于EGFL-7的保守型内含子miRNA，主要在内皮细胞中表达，在多种癌症中异常表达，与肿瘤的发生发展密切相关[15]。miR-126-5p在胃癌细胞SGC-7901中可靶向EZH2增加胃癌细胞的放射敏感性[16]。miR-126-5p在非小细胞肺癌(NSCLC)中低表达，其过表达可抑制细胞中苹果酸脱氢酶1(MDH1)的酶活性、线粒体呼吸并导致细胞死亡[17]。且有研究表明，在NSCLC患者放疗敏感组中miR-126表达上调[18]，miR-126通过PI3K-Akt途径促进辐射诱导的NSCLC细胞凋亡[19]。以上结果均说明miR-126-5p对癌细胞的放疗敏感性具有重要作用。本研究结果发现，miR-126-5p在肺癌细胞A549、SPC A1和HCI-H596中含量均显著下调，与上述结果[17]一致；双荧光素酶报告系统和qRT-PCR结果显示，在A549细胞中，VIM-AS1靶向负调控miR-126-5p的表达，本研究还发现，抑制miR-126-5p表达同时沉默VIM-AS1后A549细胞细胞存活分数显著升高，凋亡率显著降低，细胞增敏比为0.598，逆转沉默VIM-AS1对A549细胞凋亡和放射敏感性的影响，间接证实了二者在A549细胞中具有调控过程，并可增强细胞放射敏感性。

综上所述，本研究阐述了在肺癌细胞A549、SPC A1和HCI-H596中lncRNA VIM-AS1上调，miR-126-5p下调，在肺癌A549细胞中lncRNA VIM-AS1靶向miR-126-5p调控A549细胞凋亡和放射敏感性。lncRNA VIM-AS1可能是肺癌的放射增敏靶点。