皮革及其制品中三氯生的测定

2021-08-17闫杰王成云王飞林君峰刘志红沈雅蕾张嘉丽曾锦嫦杨左军谢堂堂

皮革与化工 2021年4期

闫杰，王成云，王飞，林君峰，刘志红，沈雅蕾，张嘉丽，曾锦嫦，杨左军,谢堂堂★

（1.深圳海关工业品检测技术中心，广东深圳 518067;2.深圳市检验检疫科学研究院，广东深圳 518010；3.深圳国际旅行卫生保健中心，广东深圳 518033；4.深圳职业技术学院应用化学与生物技术学院，广东深圳 518000）

0 引言

人们追求安全、清洁的高品质生活，但在使用皮革制品时很少进行专门的清洗，从而导致其表面污垢累积和细菌大量繁殖，因此皮革抗菌问题逐渐引起人们的关注[1]。皮革制品的生产经历三个阶段，第1个阶段是准备工段，第2个阶段是鞣制工段，包括鞣制、染色、加油等工序，第3个阶段是整理工段，皮革被拉伸后进行切割，并在光滑表面上用各种涂饰剂进行处理以使其美观，抗菌整理一般在第2个阶段进行。皮革的胶原纤维以多孔型网状形式存在，从而可让抗菌剂渗透进入。胶原纤维本身含有羧基、氨基、亚氨基、羟基等多种极性基团，可与抗菌剂中的极性基团进行交联。三氯生是一种常用的抗菌剂，大量用于纺织品、日化产品、皮革等产品的抗菌整理[2-7]。三氯生含有羟基，可通过乙二醛、戊二醛等二醛类助剂与皮革胶原纤维发生交联，从而在皮革纤维中引入抗菌剂三氯生，赋予皮革抗菌性能[1]。

但是三氯生能干扰甲状腺荷尔蒙的正常分泌，且对水生动植物有毒[8-10]。因此欧盟法规(EU)No.169/2010限制在纺织品中使用三氯生[11]，2010/675/EU指令禁止在消费品中使用三氯生[12]，欧盟生物杀灭产品法规(EU)No.528/2012限制在杀菌剂中使用三氯生[13]。2015年，欧洲化学品管理局正式全面禁用三氯生，2016年美国食品与药品管理局(FDA)禁止在抗菌洗涤品中使用三氯生。目前已有大量文献报道了纺织品、日化产品、印染助剂中三氯生的测定[14-25]，但只有周佳等采用超高效合相色谱法测定了皮革中的三氯生[26]，大部分实验室均未配备合相色谱，极大地限制了该方法的应用。本文采用超声萃取技术提取皮革及其制品中的三氯生，提取液经固相萃取柱净化后进行超高效液相色谱/串联质谱法(UPLC/MS-MS)测定，从而建立了1个皮革及其制品中三氯生含量的UPLC/MS-MS分析方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290 Infinity II-6495超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪(美国Agilent公司)，配Agilent 1290 Infinity II超高效液相色谱仪和Agilent 6495 Triple Quad三重四极杆串联质谱仪；Retsch SM 200切割式织物研磨仪(德国Retsch公司)。

标准品：三氯生(纯度99.5%)由德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司提供，用色谱纯甲醇(美国Merck公司)配制成浓度为44.80μg/mL的标准储备液。

阳性样品：市售粒面牛皮革。

1.2 样品前处理

选取有代表性的样品，裁成小块后，经Retsch切割式织物研磨仪磨成粉末。称取1 g样品，置于50 mL反应瓶中，加入25 mL乙醇，在45℃下超声萃取30 min。过滤，滤液经固相萃取柱(已用5 mL乙醇进行预活化)净化后，定容至25 mL，经滤膜过滤后进行UPLC/MS-MS分析。

1.3 分析条件

1.3.1 液相色谱条件

Agilent Eclipse Plus C18RRHD色谱柱(150 mm×2.1 mm×3.5μm)，等梯度洗脱，流动相为甲醇/水=90/10，流速为0.25 mL/min，柱温为40℃，进样量为5μL。

1.3.2 质谱条件

毛细管电压为-3500V，碰撞气为高纯氮气（纯度＞99.999%），吹扫气和鞘气均为氮气，流速均为11 L/min，吹扫气和鞘气温度分别为250℃、350℃。EI离子源，负离子扫描模式，动态MRM监测模式，保留时间为tR=4.194 min，ΔtR=2%tR。离子对分别为m/z 286.7→m/z 35.0（定量离子对）、m/z 286.7→m/z 142.1。碰撞电压均为-35V，池加速电压均为3 V。

2 结果与讨论

2.1 净化条件选择

皮革样品基质复杂，在萃取过程中，大量杂质伴随待测组分一起被萃取出来，严重干扰待测组分的测定，因此必须进行净化处理。固相萃取柱净化是一种常见的净化处理手段，经固相萃取柱净化后，会损失部分目标分析物，且净化处理过程也有可能会引入新的杂质。在不含三氯生的皮革萃取液中加入三氯生标准溶液，然后分别用Waters Sep-Pak Vac Silica柱（1 g/6 mL）、Waters Sep-Pak Vac C18柱（0.5g/3mL）、Cleanert PA SPE柱（1g/6mL）、Anpelclean PA SPE柱（1g/6mL）、Supelclean LC-PH Tubes柱(0.5g/3mL)、CNW Bond Alumina-N SPE Cartridge柱(1g/6mL)、Supelclean ENVI-18 Tubes柱（0.5g/3mL）、Varian HF C18柱（2g/12mL）、Agilent Si柱（1g/6mL）、Agilent Al-N柱（0.5g/3mL）、Varian Bond Elut SCX柱（0.5g/3mL）等11种常见固相萃取柱对萃取液进行净化，测定净化后三氯生的峰面积，并与未过柱净化的同一浓度的三氯生标准溶液的峰面积进行比较，各萃取柱的回收率分别为66.00、79.65、80.57、81.87、84.58、10.21、87.47、70.48、78.71、81.82、99.59%。选择回收率最高的Varian Bond Elut SCX柱（0.5g/3mL）作为净化柱。

2.2 超声萃取条件选择

决定超声萃取效率的因素有5个：萃取溶剂种类、萃取溶剂体积、萃取时间、萃取温度和萃取方式。首先以甲醇为萃取溶剂，超声萃取1个市售阳性样品中的三氯生，分别考察萃取温度(A)、萃取时间(B)、萃取溶剂体积(C)三个因素对萃取量的影响。萃取温度分别为35、40、45、50、55、60℃，用25 mL甲醇萃取30 min，萃取量分别为28.64、35.76、39.39、39.17、39.03、38.78 mg/kg，在45℃时达到最大值。萃取时间分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min，45℃下用25 mL甲醇萃取，萃取量分别为16.93、20.75、28.54、33.67、36.42、39.39、36.28、35.79、35.46、35.34、34.87、34.52 mg/kg，在30 min时达到最大值。分别以15、20、25、30、35 mL甲醇作为萃取溶剂，45℃下萃取30 min，萃取量分别为24.68、37.21、39.39、36.74、35.45 mL，在25 mL时达到最大值。因此设计了如表1所示的正交试验来综合考察3个因素对萃取量的影响，在表1给出的9个实验条件下分别进行超声萃取，萃取量也列于表1中。根据表1中的数据，分别计算3个因素的k值和极差，确定优方案为A1B1C1。在此条件下，分别以甲醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯/二氯甲烷(1∶1，V/V)、乙酸乙酯、乙醇、叔丁基甲醚、石油醚等8种常见溶剂作为萃取溶剂对阳性样品进行超声萃取，其萃取量分别为39.39、31.59、34.34、27.50、20.69、45.13、17.45、16.45 mg/kg。由此可见，乙醇的萃取效果最好。以25 mL乙醇为萃取溶剂，在优方案给定的萃取条件下对阳性样品进行连续3次超声萃取，第1、2、3次萃取量分别为45.13、1.74、0.31 mg/kg。第1次萃取量占总萃取量的95.65%，因此最终选择1次超声萃取方式。

表1 正交实验结果

2.3 分析条件优化

分别采用甲醇/水、乙腈/水作为流动相进行分析，结果发现，使用甲醇/水作为流动相时，三氯生的响应值明显较大。在水相中分别加入0.1%甲酸、0.01 mol/L甲酸铵、0.01 mol/L乙酸铵，观察响应值的变化，结果发现，三氯生的响应反而变小。因此，选择甲醇/水作为流动相。

以甲醇/水作为流动相，考察不同柱温、流速、洗脱梯度下三氯生响应值的变化，结果发现，当采用1.3节给出的分析条件时，三氯生谱峰尖锐，对称性好。

根据三氯生分子结构可知三氯生在负离子模式下有较高的响应值，经ESI-电离产生特征离子峰[M-H]-为母离子峰，三氯生的母离子为m/z 286.70。以质量浓度为112 ng/mL的三氯生标准溶液为对象，对质谱条件进行优化。在碰撞电压分别为10、30、50、70 V的条件下，用高纯氮气对母离子m/z 286.70进行碰撞，各产生一系列的二级子离子。母离子与其产生的1个二级子离子组成1个离子对。选择4个丰度较高的离子对利用Optimizer优化软件进一步细致优化碰撞能量。细致优化时，碰撞电压从1 V逐步增加至79 V，增长步长为2 V。观察各离子对在不同碰撞电压下响应值的变化情况，选择丰度最大时的电压作为优化后的碰撞电压。进行动态MRM监测时，为了最大限度地利用离子的驻留时间,保证每个峰都能获得足够的数据点，只在化合物离子出峰前后的时间段内对该化合物的离子进行质谱扫描,从而在保持恒定循环时间的同时增强了分析物的信噪比,获得更高的灵敏度[27]。本实验中，质谱扫描时间段为ΔtR=2%tR。确定优化碰撞电压后，对毛细管电压、鞘气温度、鞘气流速、吹扫气温度、吹扫气流速等参数进行优化,通过单因素实验的方法,确定优化后的条件。

在确定的优化条件下对质量浓度为84 ng/mL的三氯生标准溶液进行分析，UPLC/MS-MS谱图见图1，在tR=4.194 min处出现1个对应于三氯生的尖锐谱峰。

图1 三氯生标准溶液的UPLC/MS-MS图

2.4 方法的线性范围和定量下限

用甲醇对三氯生标准溶液进行稀释，配制质量浓度(ρ)分别为7、14、28、56、84、112、168、224、336、448 ng/mL的标准工作液，按1.3节给定的分析条件进行测试，峰面积(A)分别为6698、10015、17482、31349、45832、62103、91467、119977、181975、233783。用峰面积(A)对质量浓度(ρ)作图，结果发现，当三氯生的质量浓度(ρ)为7～448 ng/mL时，峰面积(A)与质量浓度(ρ)之间存在良好的线性关系，线性方程为A=521.71ρ+3011.2，线性相关系数为0.9998。按10倍信噪比(S/N=10)来计算定量下限，仪器的定量下限为4μg/kg，方法的定量下限为0.1 mg/kg。