高效液相色谱法同时测定和肝利胆颗粒中3 种黄酮类成分含量*

2021-08-16吴远波吴克勤刘宇政

中国药业 2021年15期

吴远波，吴克勤，刘宇政，王伟，吴靓，张鸿

（江西省医学科学院，江西南昌 330006）

和肝利胆颗粒是由金钱草、茵陈、枳壳（炒）、黄芩等8 味中药制成的颗粒剂，具有清热利湿、舒肝理气功效，用于治疗急性黄疸型肝炎、慢性肝炎活动期、急慢性胆囊炎［1］，是治疗肝胆病的常用药［2］。现行标准收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂（第七册）》［1］，但仅有化学鉴别项，无含量测定项，质量控制水平低，难以有效控制产品质量。枳壳、黄芩为方中主药，枳壳的有效成分为柚皮苷、新橙皮苷［3］246，黄芩的有效成分为黄芩苷［3］301，均为黄酮类成分，且含量较高，均为药材的质控指标。参考文献［4 －6］，柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷可在同一条件下被检识。已有对黄芩中的黄芩苷［7］，对栀子、黄芩中的栀子苷和黄芩苷［2］，以及对和肝利胆糖浆中柚皮苷［8］含量测定的报道，但尚未见同时检测枳壳、黄芩中多种黄酮类成分的研究。本研究中建立了同时测定和肝利胆颗粒中柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷3 种黄酮类成分含量的高效液相色谱法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Thermo Scientific UltiMate 3000 型高效液相色谱仪（美国 Thermo Fisher 公司），配有四元梯度泵、WPS－3000SL 型自动进样器、TCC－3000RS 型柱温箱、DAD－3000 型检测器；EX125ZH 型电子天平（精度为十万分之一），FR124CN 型电子天平（精度为万分之一），均购自奥豪斯仪器有限公司；KQ－500E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为500W，频率为40kHz）；DK－98－ⅡA 型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试药

柚皮苷对照品（批号为110722－201815，含量为91.7%，中国食品药品检定研究院）；新橙皮苷对照品（批号为wkq20020402，含量为99.0%），黄芩苷对照品（批号为wkq20010908，含量为98.7%），均购自四川省维克奇生物科技有限公司；和肝利胆颗粒（企业A，批号分别为 181032，190345，200215；企业 B，批号为9H010972057；企业 C，批号分别为 190201，191201）；乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Agilent Zorbax SB C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈－ 0.2% 磷酸溶液（20 ∶80，V ／ V）；流速：1.0 mL ／min；检测波长：283 nm；柱温：20 ℃；进样量：10 μL。在此色谱条件下，供试品溶液色谱中，柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷峰的分离度均大于1.5，理论板数按柚皮苷峰计不低于5 000。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图1.naringin 2.neohesperidin 3.baicalinA.Mixed reference solution B. Test solution C.Negative reference solution lacking Fructus aurantii D. Negative reference solution lacking Scutellaria baicalensisFig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液制备

分别取柚皮苷对照品、新橙皮苷对照品、黄芩苷对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，制成含柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷质量浓度分别为 399.81，399.44，497.89 μg ／mL 的对照品贮备液。分别精密量取上述贮备液各适量，置同一容量瓶中，加甲醇稀释，制成含柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷质量浓度分别为 39.98，39.94，99.58 μg／mL 的混合对照品溶液。取样品，研细，取 2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，超声（功率为500 W，频率为40 kHz）处理30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按样品处方比例制备不含枳壳和黄芩的阴性样品，按供试品溶液制备方法分别制备缺枳壳和黄芩的阴性样品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别取 2.2 项下 3 种溶液各 10 μL，按2.1 项下色谱条件注入液相色谱仪测定，并记录色谱图。结果柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷均能与其他杂质峰基线分离，阴性样品溶液对测定结果均无干扰。

线性关系考察：精密吸取对照品溶液 1，3，5，8，10，20 μL，按2.1 项下色谱条件注入液相色谱仪测定，以峰面积（Y）为纵坐标、对照品进样量（X，μg）为横坐标进行线性回归，得回归方程 Y柚＝26.089 0 X柚＋0.479 4（r ＝ 0.999 5，n ＝ 6），Y新＝ 29.019 0 X新＋ 0.379 0（r ＝0.999 5，n ＝6），Y黄＝52.109 0X黄－0.399 4（r ＝0.999 8，n ＝6）。结果表明，柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷的进样量分别在 0.039 98 ～0.799 60 μg，0.039 94 ～ 0.798 80 μg，0.099 58 ～1.991 60 μg 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取混合对照品溶液10 μL，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录色谱图。结果柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷峰面积的 RSD 分别为0.15%，0.15%，0.14%（n ＝ 6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为9H010972057）样品，按2.2 项下方法平行制备供试品溶液6 份，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，分别计算含量。结果柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷的平均含量分别为0.855，0.793，2.942 mg／g，RSD 分别为 1.02% ，0.78%，0.60%（n ＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取重复性试验项下供试品溶液，分别于 0，2，4，8，12，24 h 时按 2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图，并计算 RSD。结果柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷峰面积的 RSD 分别为 0.78% ，0.82%，0.66% （n ＝ 6），表明供试品溶液在室温条件下24 h 内稳定。

加样回收试验：取同一批（批号为9H010972057）已知含量样品适量，研细，平行取6 份，每份1 g，精密称定，分别精密加入柚皮苷对照品贮备液、新橙皮苷对照品贮备液各 2 mL，黄芩苷对照品贮备液 6 mL，按2.2 项下方法制备供试品溶液，进样测定，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n ＝6）Tab.1 Results of the recovery tests（n ＝ 6）

耐用性试验：考察了不同品牌色谱柱（Agilent Zorbax SB C18柱、Capcell Pak C18柱、Thermo Scientific Syncronis C18柱）对检测结果的影响，结果供试品溶液在3 种色谱柱上均能得到较好分离；考察了不同柱温（20，25，30 ℃）对检测结果的影响，结果柱温对色谱行为有较大影响，柱温在20 ℃时分离效果最佳；考察了不同比例流动相乙腈－ 0.2% 磷酸溶液（18 ∶82，20 ∶80，22 ∶82，25 ∶75，30 ∶70，V ／ V）对检测结果的影响，结果使用前 3 种比例的流动相均能达到分离要求，使用后2 种比例的流动相时柚皮苷峰与杂质峰无法有效分离，故最终选择乙腈－0.2%磷酸溶液（20 ∶80，V ／ V）作为流动相。

2.4 样品含量测定

取 6 批样品适量，研细，取 2 g，精密称定，按 2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果见表2。

表2 每袋和肝利胆颗粒样品含量测定结果（mg）Tab.2 Content determination of three flavonoids in each bag of Hegan Lidan Granules（mg）

3 讨论

3.1 波长选择

采用二极管阵列检测器在190 ～400 nm 波长范围检测［9－10］，结果最大吸收波长柚皮苷和新橙皮苷均为283 nm，黄芩苷为277 nm。样品中柚皮苷、新橙皮苷的含量相对较低，为了提高柚皮苷、新橙皮苷的检测灵敏度，故检测波长选择283 nm。在此波长下，3 种黄酮类成分的色谱峰形均较好，检测灵敏度均能达到检测要求，且无其他杂质峰干扰。

3.2 提取条件选择

选择超声提取60 min，对不同提取溶剂（30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇）进行考察，以样品中柚皮苷、新橙皮苷、黄芩苷的综合提取率为指标，结果以70%甲醇为提取溶剂时，3 种成分的提取效果最佳。对不同提取方式（超声处理和加热回流提取）和不同提取时间（15，30，45，60 min）进行考察，最终确定提取条件为70%甲醇超声提取30 min。