活性小分子DHMBA含氮衍生物的合成及其抑菌活性

林啟福, 黄精彩,2, 陈海峰, 王 红, 米文静, 王玉军*

(1. 北部湾大学 广西北部湾海洋生物多样性养护重点实验室，广西 钦州 535011; 2. 广西大学 生命科学与技术学院，广西 南宁 530004)

牡蛎又名生蚝，肉可鲜食，营养丰富，素有“海中牛奶”之称，同时还可入药。目前对于牡蛎的药用成分开发主要集中在牡蛎蛋白分子或多糖分子中，而对于牡蛎中的一些小分子成分及其药理活性的研究甚少。2012年，Chiba等[1]从太平洋牡蛎Crassostreagigas中分离得到天然的酚类抗氧化剂3,5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol，并命名为DHMBA。随后该课题组还进一步研究了该化合物的抗氧化机理以及活性[2]，发现DHMBA是一种新型、有效的抗氧化剂，能有效保护肝细胞免受氧化应激引起的凋亡和坏死[3]，具有体外肝细胞保护作用，富含DHMBA的牡蛎提取物在预防或减轻非酒精性脂肪性肝炎(NASH)方面具有很大的潜力[4]。此外，其团队还通过体内微透析实验和体外脑切片实验中大鼠的谷氨酸能神经元活性分析发现DHMBA和Zn2+结合在静态条件下能抑制谷氨酸能神经元活性[5]。目前，关于DHMBA结构修饰的文献报道并不多，而且尚未有抑菌活性方面的研究，Vergne等[6]将DHMBA分子修饰成具有噻二唑结构的化合物，并发现其具有显著抑制磷酸二酯酶(PDE7A1)的活性，抑制效果达到纳摩尔级；Daikonya等[7]通过化学修饰将DHMBA分子转化为黄酮化合物，并通过生物活性研究发现其具有抑制小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)产生和释放一氧化氮的作用。

缩氨基硫脲衍生物具有较高的抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗疟疾、抗结核等生物活性，在医药和临床领域备受关注[8-12]。其中，=NNHC(S)NH-结构为缩氨基硫脲化合物的基本活性单元，氮上的不同结构会影响其抗菌和抗肿瘤等生物活性[13-14]。许多芳香醛酮和杂环醛酮缩氨基硫脲均具有很好的抗菌活性，并且还可以通过在芳杂环醛酮的环上引入不同的取代基使其抗菌活性得到改善[15-16]。因此，取代苯甲醛缩氨基硫脲类化合物己引起广大药学和化学工作者的研究兴趣。

为寻找高效低毒的抗菌药物，本研究以没食子酸甲酯为原料，通过甲基化、LiAlH4还原反应，得到活性小分子DHMBA，而后通过PCC氧化、缩合反应，得到其缩氨基硫脲衍生物；为进一步进行构效分析，分别选用与DHMBA结构相近的丁香醛和2,3,4-三羟基苯甲醛作为原料，通过缩合反应得到一系列的取代苯甲醛缩氨基硫脲衍生物(Scheme 1)。同时，选用大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)对合成物进行抑菌活性测试。

Scheme 1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

X-4型熔点仪；Bruker AV-600 MHz型核磁共振仪(TMS为内标)；Agilent 6210 LC/MSD TOF型高分辨质谱仪。

大肠杆菌(Escherichiacoli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)由北部湾大学海洋学院提供；其余所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1) 3,5-二羟基-4-甲氧基苯甲酸甲酯(1)的合成

取没食子酸甲酯1.02 g(5.4 mmol)溶解于10 mL DMF，加入碳酸钾0.91 g(6.5 mmol)，在85 ℃油浴下搅拌1 h；然后将反应用冰水浴冷却至0 ℃，加入碘甲烷0.82 g(5.6 mmol)，搅拌30 min；升至室温继续搅拌24 h[TLC跟踪，展开剂：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/2]。用乙酸乙酯(3×30 mL)萃取，合并有机相，减压浓缩，残余物经硅胶柱层析[洗脱剂：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/3]纯化得白色固体1，收率81%, m.p.148～149 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 9.48(s, 2H, -OH), 6.95(s, 2H, Ar-H), 3.77(s, 3H, OCH3), 3.74(s, 3H, -COOCH3);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 166.1, 150.8, 139.8, 124.5, 108.6, 59.7, 51.9。以上数据与文献[17]报道数据一致。

(2) 3,5-二羟基-4-甲氧基苯甲醇(2)的合成

将氢化铝锂1.82 g(48.0 mmol)溶解于50 mL的四氢呋喃中，置于冰水浴中，保持温度为0 ℃。另取化合物12.38 g(12.0 mmol)溶解于10 mL的四氢呋喃中，慢慢滴加到上述的氢化铝锂溶液中，滴加完毕后室温搅拌0.5 h；再置于油浴中，保持55 ℃搅拌反应2 h[TLC跟踪，展开剂：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/1]。加入乙酸乙酯和饱和食盐水溶液，过滤除去沉淀，滤液用乙酸乙酯(3×30 mL)萃取，合并有机相，减压浓缩，残余物经硅胶柱层析[洗脱剂：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/1]纯化得白色固体3，收率75%, m.p.170～172 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.92(s, 2H, -OH), 6.27～6.28(m, 2H, Ar-H), 4.50(m, 1H, -OH), 4.28(d, 2H,J=5.4Hz, -CH2-), 3.66(s, 3H, -OCH3);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ:150.6, 138.1, 134.3, 105.7, 63.1, 59.9; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C8H11O4{[M+H]+}171.0657, found 171.0656。以上数据与文献[1]报道数据一致。

(3) 3,5-二羟基-4-甲氧基苯甲醛(3)的合成

通过具有较高实效性高的土壤采集方法对土样进行采集操作，结合不同类型作物和土壤的研究结果证实，不同区域土壤的实际肥力也存在一定差异，同时，为了满足大豆种植所需要的肥力水平，需要对化肥的调配比例、使用时间和品种也进行针对性的选择。依据农家肥料的具体情况，选择实际使用的化肥量，一般每公顷大豆种植区域可通过分层法施加15t左右的农家肥，其中，首先的施肥深度为5～10cm，再次施肥深度为10～15cm，经适当的施肥方式，能够最大限度提高化肥的使用效果，保证肥力提升3～5%左右。

取氯铬酸吡啶盐酸盐PCC 0.86 g(4.0 mmol)溶解于10 mL的四氢呋喃中，置于冰水浴中，保持温度为0 ℃。另取化合物20.34 g(2.0 mmol)溶解于5 mL四氢呋喃中，慢慢滴加到上述氯铬酸吡啶盐酸盐溶液中，搅拌下反应24 h[TLC跟踪，展开剂：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/2]。过滤，减压浓缩，残余物经硅胶柱层析分离[展开剂：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/3]纯化得白色固体3，收率45%, m.p.149～151 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 9.71(s, 1H, -CHO), 9.62(s, 2H, -OH), 6.86(s, 2H, Ar-H), 3.77(s, 3H, -OCH3);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 192.1, 151.3, 141.1, 131.8, 108.7, 59.8; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C8H9O4{[M+H]+}169.0501, found 169.0499。

(4) 化合物(4a、5a、6a)的合成(以4a为例)

将化合物384 mg(0.5 mmol)溶解于5 mL的乙醇中，置于75 ℃的油浴中，用盐酸调节pH为3～5，加入盐酸羟胺42 mg(0.6 mmol)，继续反应2 h[TLC跟踪，展开剂：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/1]。反应结束后，减压浓缩，残余物经硅胶柱层析[洗脱剂：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/1]纯化得白色固体4a。分别以丁香醛和2,3,4-三羟基苯甲醛作为原料，用类似方法合成化合物5a和6a。

3,5-二羟基-4-甲氧基苯甲醛肟(4a)： 白色固体，收率86%, m.p.171～172 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 10.96(s, 1H, N-OH), 9.20(s, 2H, -OH), 7.87(s, 1H, -CH=N), 6.55(s, 2H, Ar-H), 3.68(s, 3H,-OCH3);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 150.9, 148.0, 136.6, 128.3, 105.7, 59.7; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C8H10NO4{[M+H]+}184.0610, found 184.0611。

3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲醛肟(5a)： 白色固体，收率84%, m.p.121～122 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 8.05(s, 1H, -CH=N), 6.84(s, 2H, Ar-H), 3.91(s, 6H, -OCH3);13C NMR(150 MHz, CDCl3)δ: 150.6, 147.4, 136.8, 123.4, 104.1, 56.5; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C9H12NO4{[M+H]+}198.0766, found 198.0760。

2,3,4-三羟基苯甲醛肟(6a)： 淡黄色固体，收率76%, m.p.173～174 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 11.01(s, 1H, -OH), 9.85(s, 1H, -OH), 9.33(s, 1H, -OH), 8.37(s, 1H, N-OH), 8.19(s, 1H, -CH=N), 6.72(d, 1H,J=8.4 Hz, Ar-H), 6.35(d, 1H,J=8.4 Hz, Ar-H);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 149.9, 147.8, 146.1, 132.7, 119.6, 110.3, 107.6; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C7H8NO4{[M+H]+}170.0453, found 170.0450。

(5) 化合物(4b～4d、5b～5d、6b～6d)的合成(以4b为例)

将化合物3168 mg(1 mmol)溶解于10 mL的乙醇中，置于75 ℃的油浴中，用盐酸调节pH为3～5，加入氨基硫脲110 mg(1.2 mmol)，继续反应2 h[TLC跟踪，展开剂：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/1]。减压浓缩，残余物经硅胶柱层析[洗脱剂：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/1]纯化得淡黄色固体4b。用类似方法合成化合物4c～4d、5b～5d和6b～6d。

3,5-二羟基-4-甲氧基苯甲醛缩氨基硫脲(4b)： 淡黄色固体，收率75%, m.p.170～171 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ:11.26(s, 1H, -NH), 9.19(s, 2H, -OH), 8.11(brs, 1H, -NH), 7.83(s, 1H, -CH=N), 7.71(brs, 1H, -NH), 6.70(s, 2H, Ar-H), 3.70(s, 3H, -OCH3);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 177.7, 150.9, 142.9, 137.4, 129.3, 106.6, 59.9; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C9H12N3O3S{[M+H]+}242.0599, found 242.0601。

3,5-二羟基-4-甲氧基苯甲醛缩(N-甲基氨基硫脲)(4c)： 淡黄色固体，收率77%, m.p.169～170 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 11.28(s, 1H, -NH), 9.19(s, 2H, -OH), 8.33(q, 1H,J=4.2 Hz, -NH), 7.83(s, 1H, -CH=N), 6.72(s, 2H, Ar-H), 3.71(s, 3H,-OCH3), 3.00(d, 3H,J=4.8 Hz, N-CH3);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 177.5, 150.8, 142.3, 137.3, 129.5, 106.6, 59.8, 30.8; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C10H14N3O3S{[M+H]+}256.0756, found 256.0756。

3,5-二羟基-4-甲氧基苯甲醛缩(N-苯基氨基硫脲)(4d)： 淡黄色固体，收率76%, m.p.153～154 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 11.65(s, 1H, -NH), 9.96(s, 1H, -NH), 9.21(s, 2H, -OH), 7.94(s, 1H, -CH=N), 7.58(d, 2H,J=7.2 Hz, Ar-H), 7.36(t, 2H,J=7.8 Hz, Ar-H), 7.19(t, 1H,J=7.2 Hz, Ar-H), 6.82(s, 2H, Ar-H), 3.71(s, 3H, OCH3);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 175.6, 150.9, 143.4, 139.1, 137.5, 129.2, 128.1, 125.4, 125.2, 106.9, 59.9; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C15H16N3O3S{[M+H]+}318.0912, found 318.0914。

3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲醛缩氨基硫脲(5b)： 淡黄色固体，收率82%, m.p.113～114 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 11.31(s, 1H, -NH), 8.79(s, 1H, -OH), 8.13(brs, 1H, -NH), 8.00(brs, 1H, -NH), 7.92(s, 1H, -CH=N), 7.04(s, 2H, Ar-H), 3.80(s, 6H,-OCH3);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 177.4, 148.1, 142.9, 137.7, 124.4, 104.9, 56.1; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C10H14N3O3S{[M+H]+}256.0756, found 256.0753。

3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲醛缩(N-甲基氨基硫脲)(5c)： 淡黄色固体，收率86%, m.p.233～234 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 11.38(s, 1H, -NH), 8.82(s, 1H, -OH), 8.38(q, 1H,J=4.2 Hz, -NH), 7.93(s, 1H, -CH=N), 7.04(s, 2H, Ar-H), 3.82(s, 6H,-OCH3), 3.04(d, 3H,J=4.8 Hz, N-CH3);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 177.4, 148.1, 142.6, 137.8, 124.4, 105.0, 56.2, 30.8; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C11H16N3O3S{[M+H]+}270.0912, found 270.0912。

3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲醛缩(N-苯基氨基硫脲)(5d)： 淡黄色固体，收率87%, m.p.178～179 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 11.74(s, 1H, -NH), 9.99(s, 1H, -NH), 8.88(s, 1H, -OH), 8.05(s, 1H, -CH=N), 7.57(d, 2H,J=7.8 Hz, Ar-H), 7.36～7.39(m, 2H, Ar-H), 7.20～7.23(m, 1H, Ar-H), 7.13(s, 2H, Ar-H), 3.83(s, 6H, OCH3);13C NMR(150MHz, DMSO-d6)δ: 175.6, 148.1, 143.7, 139.2, 138.1, 128.1, 126.2, 125.4, 124.1, 105.4, 56.2; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C16H18N3O3S{[M+H]+}332.1069, found: 332.1060。

2,3,4-三羟基苯甲醛缩氨基硫脲(6b)：黄色固体，收率72%, m.p.252～253 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 11.20(s, 1H, -OH), 9.51(s, 1H, -NH), 8.97(s, 1H, -NH), 8.43(s, 1H, -NH), 8.24(s, 1H, -OH), 7.95(s, 1H, -OH), 7.75(s, 1H, -CH=N), 7.12(d, 1H,J=8.4 Hz, Ar-H), 6.33(d, 1H,J=8.4 Hz, Ar-H);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 177.0, 148.3, 146.6, 142.1, 132.7, 118.2, 112.6, 107.8; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C8H10N3O3S{[M+H]+}228.0443, found 228.0444。

2,3,4-三羟基苯甲醛缩(N-甲基氨基硫脲)(6c)： 黄色固体，收率73%, m.p.221～222 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 11.22(s, 1H, -OH), 9.50(s, 1H, -OH), 8.98(brs, 1H, -NH), 8.43(s, 1H, -OH), 8.26(q, 1H,J=4.8 Hz, -NH), 8.23(s, 1H, -CH=N), 7.15(d, 1H,J=8.4 Hz, Ar-H), 6.34(d, 1H,J=8.4 Hz, Ar-H), 2.98(d, 3H,J=4.8 Hz, N-CH3) ;13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 177.1, 148.1, 146.5, 141.4, 132.7, 118.0, 112.7, 107.6, 30.8; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C9H12N3O3S{[M+H]+}242.0599, found 242.0592。

2,3,4-三羟基苯甲醛缩(N-苯基氨基硫脲)(6d)：黄色固体，收率70%, m.p.185～186 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 11.60(s, 1H, -OH), 9.93(s, 1H, -OH), 9.56(s, 1H, -OH), 9.04(brs, 1H, -NH), 8.49(brs, 1H, -NH), 8.37(s, 1H, -CH=N), 7.58(d, 2H,J=7.8 Hz, Ar-H), 7.33～7.36(m, 2H, Ar-H), 7.30(s, 1H, Ar-H), 7.16～7.18(m, 1H, Ar-H), 6.37(d, 1H,J=9.0 Hz, Ar-H);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 175.1, 148.5, 146.8, 142.3, 139.3, 132.8, 128.0, 125.3, 125.0, 118.4, 112.5, 107.8; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C14H14N3O3S{[M+H]+}304.0756, found 304.0756。

1.3 抑菌活性测试

采用滤纸片法测定化合物的抑菌活性。以DMSO为溶剂，将样品配制成10， 20和40 mg·mL-1的溶液；配制培养基，并灭菌、接种、细菌培养；采用涂布法将细菌在培养皿上涂布均匀，将直径为6 mm的滤纸片分别用不同浓度的合成物样液浸泡后，标记放于培养皿中，于37 ℃培养箱内孵育24 h，测量抑菌圈直径，重复3次取平均值；以硫酸庆大霉素为阳性对照，DMSO为空白对照。

2 结果与讨论

2.1 合成

以没食子酸甲酯为原料，通过甲基化和氢化铝锂还原两步反应制得活性小分子DHMBA，总收率达到61%；而用PCC氧化DHMBA制备3,5-二羟基-4-甲氧基苯甲醛(3)的收率不高(仅45%)，可能是由于DHMBA苯环上的羟基也易受氧化，生成副产物导致收率不高。通过缩合反应制备肟类衍生物和缩氨基硫脲类衍生物的过程中，增加羟胺和氨基硫脲类化合物的用量，使其适当过量可以提高收率，能以较好的收率(70%～87%)得到相应的目标产物。

2.2 抑菌活性

表1为化合物2～6的抑菌活性测试结果。由表1可知，活性小分子DHMBA(2)及其醛类衍生物3的抑菌效果不显著，仅当其浓度达到40 mg·mL-1时，才对大肠杆菌表现出微弱的抑制活性，对金黄色葡萄球菌则未显示出抑菌活性；通过结构修饰，其含氮衍生物4a～4d的抑菌活性均有所增强，在10～40 mg·mL-1内，对受试菌种均表现出一定的抑制活性。初步的构效关系显示，(1)对比缩氨基硫脲类衍生物的抑菌活性，肟类衍生物4a、5a和6a的抑菌效果较差；(2)缩氨基硫脲类衍生物氮上的取代基对其抑菌活性有一定的影响，不含取代基时抑菌效果最佳；(3)苯环上羟基的个数越多，抑菌活性越显著，含氮衍生物6a～6d的抑菌效果最佳，4a～4d次之，5a～5d的效果最差。

表1 目标化合物的抑菌活性*

合成了牡蛎中的活性小分子DHMBA，并对其结构进修饰，合成了DHMBA的含氮衍生物(4a～4d)；分别以丁香醛和2,3,4-三羟基苯甲醛作为原料，合成其含氮衍生物(5a～5d)和(6a～6d)。初步的抑菌活性测试结果表明,缩氨基硫脲类衍生物4b、6b和6d对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌两种受试菌株的抑菌效果最好，具有进一步研究的价值。