基于响应面分析法的湖羊肉复配保鲜剂工艺优化

董璇 何珊 魏雨晴 张杰辉 陈梦璇 张斌

摘 要：本研究以肉桂精油、壳聚糖与葡萄籽提取物作为原料，基于响应面分析法得到湖羊肉复配保鲜剂最佳配方。在单因素实验基础上，以4℃条件下贮藏8d的湖羊肉感官评分和菌落总数构建综合评价模型，并通过Box-Behnken实验设计优化复配保鲜剂最佳配方。响应面优化结果表明，肉桂精油体积浓度为0.12%、壳聚糖质量浓度为12.42mg/mL、葡萄籽提取物质量浓度为2.26mg/mL时湖羊肉综合评价指标最好，其理论值为8.675，优于其他实验组。为验证结果的可靠性，4℃条件下贮藏上述复配保鲜剂涂抹处理后的湖羊肉8d，结果表明，验证值与理论值间的匹配度达98.61%，这表明Box-Behnken实验对湖羊肉复合保鲜剂的配方进行优化是可行的。

关键词：湖羊肉;保鲜;响应面;肉桂精油;壳聚糖;葡萄籽提取物

中图分类号：S872  文献标识码：A  文章编号：1673-260X（2021）06-0038-07

湖羊是中国江浙两省以及太湖流域等环境湿热地区特有的绵羊品种，其体态丰满，羊毛浓密，以风味鲜美、肉质细嫩膻味轻、蛋白质含量高、脂肪含量适中、净肉率高而具有广泛的受众群体[1]。湖羊屠宰后按照加工方式的不同，可分为冷鲜肉、热鲜肉和冷冻肉三类。其中，冷鲜湖羊肉在风味、营养价值、卫生安全等方面更胜一筹。

当前文献报道较多是通过添加食品保鲜剂和调节宰后胴体冷却温度的方法来延长冷鲜肉保鲜期，但因使用的规范性、地域的差异性以及能耗的成本等方面使得上述方法在实际应用中还存在一些问题[2]。生物保鲜剂是从动植物、微生物中提取或利用现代生物工程技术得到的保鲜剂，其安全、健康、高效等特点已成为食品保鲜领域研究的热点[3]。据报道，壳聚糖[4，5]、溶菌酶[6]、天然香辛料提取物[7]、茶多酚[8]、乳酸链球菌素等[9]常用于肉类保鲜。

肉桂精油是一种安全的天然植物精油[10]。肉桂既是可食用香料又是一类天然的食品添加剂，在全球范围内被广泛应用。从肉桂中提取的肉桂精油已经得出具有很强的抗氧化和抗菌活性[11，12]。壳聚糖是一种含有游离的氨基和羟基的天然高分子聚合物，具有较好的成膜性能和抑菌效果。欧阳锐等[13]研究了生物可降解壳聚糖复合膜在鸡胸肉保鲜中的应用，结果表明在3℃下，该复合膜保藏后的鸡胸肉的挥发性盐基氮值最低、pH值最小和感官评分最高，在第7天仍属于次鲜肉，且相比空白组货架期延长了2d。葡萄籽中含有大量的活性物质，例如酚类化合物[14，15]、脂肪酸[16]、维生素以及植物甾醇[17]等，具有抗氧化、细胞周期调控[18，19]，消炎[20]、抑菌等[21]活性。葡萄籽提取物作为一种天然的生物保鲜剂，目前在食品保鲜中应用较少。

研究表明，相比于单一保鲜剂，复合天然保鲜剂对冷却羊肉在贮藏期间各项指标的提升更为显著[22]，如夏静华[23]、施荷[24]、王正云[25]等发现复配保鲜剂处理后的冷鲜肉品质优于单一保鲜剂处理。目前鲜有文献报道关于香辛料、壳聚糖、葡萄籽提取物等天然保鲜剂协同应用于冷鲜湖羊肉的研究。因此，本研究选取肉桂精油、壳聚糖、葡萄籽提取物3种天然保鲜剂，并基于Box-Behnken实验设计优化复配保鲜配方，旨在为天然复配保鲜剂的实际应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料和仪器

1.1.1 实验材料

湖羊肉，由安徽恩遠冷链物流管理有限公司生产;壳聚糖（含量99%，脱乙酰度≥90%），葡萄籽提取物（含量≥98%），由浙江一诺生物科技有限公司生产;肉桂精油，来自蚌埠农贸市场。以上材料均为食品级。铜绿假单胞菌琼脂培养基，琼脂培养基，马铃薯蔗糖琼脂培养基，由瑞楚生物科技（江苏）有限公司生产。

供试菌：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大肠杆菌（ Escherichia coli）、酵母菌 （Saccharomyce），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）均为本实验所用菌种，培养条件如表1所示。

1.1.2 实验仪器

AB323电子天平，由上海海康电子仪器厂生产;YX-24HDD手提式压力蒸汽灭菌器，由江阴滨江医疗设备有限公司生产;SW-CJ-2FD超净工作台，由上海力辰仪器科技有限公司生产;HN-60BS电热恒温培养箱，由邦西仪器科技（上海）有限公司生产;BCD-220WD11NY冰箱，由海信容声（广东）冰箱有限公司生产。

1.2 实验方法

1.2.1 不同浓度下单一保鲜剂的抑菌效果

不同浓度保鲜剂的配制：配1.0mg/mL、5.0mg/mL、10.0mg/mL、15.0mg/mL、20.0mg/mL的壳聚糖溶液;0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、4.0mg/mL、8.0 mg/mL的葡萄籽提取物溶液;0.01%、0.1%、1%、2%、5%的肉桂精油溶液备用。

不同浓度下单一保鲜剂的抑菌效果：固体培养基活化菌种后，挑取单一菌落至相应的液体培养基中，直至菌数到106-107cfu/mL时停止培养，采用打孔法测不同浓度的单一保鲜剂对不同菌液的抑制效果。

最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentra-tion，MIC）的测定：通过琼脂打孔法测定肉桂精油、壳聚糖和葡萄籽提取物的抑菌圈，抑菌圈直径≥7mm所对应的保鲜剂的浓度即为最小抑菌浓度[26]。

湖羊肉的处理方法：将样品切成1cm×1cm×1cm小块，涂抹保鲜剂后装入无菌自封袋中，并在4℃条件下贮藏8d，对其感官评分和菌落总数进行测定。

菌落总数测定方法是按照国标方法GB4789—2016测定，实验重复3次。感官检验参考Sombonpanyakul[27]和徐红艳[28]等的方法。选择已掌握感官评价基础理论并且无感官缺陷的10名同学（5男5女），对在4℃条件下贮藏8d的湖羊肉色泽、气味、弹性和组织状态给出评分。

1.2.2 响应面优化

在所选取的3种保鲜剂抑菌实验的基础上，以菌落总数和感官评价权重后的综合得分为考察指标，以肉桂精油（A，%）、壳聚糖（B，mg/mL）、葡萄籽提取物（C，mg/mL）为自变量，设计三因素三水平响应面实验，编码因素及水平见表3所示。

以综合评价指标为响应值[29]（依据参考文献和实际情况按照综合评价指标为：30%菌落总数加70%感官评价），用Design Expert 8.0.6软件进行数据的统计处理，得出最佳工艺参数。

1.2.3 保鲜效果评价

为区分不同处理组的保鲜效果，将保鲜效果评价定义为：U={lg菌落总数（u1），感官评价（u2）}，结合第8d实验结果，确定10分制的菌落总数和感官评价指标值得分标准[29]。

1.2.4 权重向量

微生物的生长是造成湖羊肉腐败的主要因素，但在实际购买过程中，消费者则是通过感官判断肉品是否新鲜，本文结合实际情况，设定权重集K= {0.3，0.7}，综合得分P=UK=0.3u1+0.7u2[29]。

1.2.5 结果验证

数据分析采用EXCEL软件，结果以“平均数±标准差”的方式表示，图形绘制使用Origin8.6软件。在4℃条件下对Box-Behnken实验设计优化得到的复配保鲜剂最佳配方做三个平行样贮藏8d的菌落总数和感官评分验证。

2 结果与分析

2.1 单一保鲜剂的抑菌效果

2.1.1 不同体积浓度的肉桂精油对四种微生物抑菌效果

如图1所示，随着肉桂精油占比的升高，各菌株抑菌圈直径变化较大，说明在一定范围内肉桂精油对这四株菌有抑制作用。其中，以铜绿假单胞菌抑菌圈直径变化最为明显，说明肉桂精油对铜绿假单胞菌的抑菌效果最好。当肉桂精油浓度为0.1%时，各菌株抑菌圈直径均大于7mm。

2.1.2 不同浓度的壳聚糖对四种微生物抑菌效果

如图2所示，随着壳聚糖浓度升高，各菌株抑菌圈直径均发生变化，说明壳聚糖对各菌株均有较好的抑制作用，但浓度不同，抑制效果最佳的菌株也不同。当壳聚糖浓度在10mg/ml时，各菌株抑菌圈直径均大于7mm。

2.1.3 不同浓度葡萄籽提取物对四种微生物抑菌效果

如图3所示，随着葡萄籽提取物浓度的升高，除铜绿假单胞菌的抑菌圈不变外，枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和酵母菌的抑菌圈直径均在增加，可见葡萄籽提取物对铜绿假单胞菌以外的3种菌落均有抑制效果。当葡萄籽提取物浓度为2.0mg/mL时，枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和酵母菌的抑菌圈直径均大于7mm。

2.2 响应面优化结果

2.2.1 二次响应面回归模型的建立与分析

基于单因素抑菌实验的结果，以菌落总数和感官评价权重后的综合得分为考察指标，以肉桂精油（A，%）、壳聚糖（B，mg/mL）、葡萄籽提取物（C，mg/mL）为自变量，通过响应面实验设计优化得到复配保鲜剂最佳配方，结果见表5。

基于Design Expert 8.0.6软件对实验结果进行回归拟合及方差分析，综合得分（P）对肉桂精油（A）、壳聚糖（B）和葡萄籽提取物（C）的回归模型如下。

P=+8.53+0.45A+0.20B-0.065C-0.10AB+0.093AC+0.30BC-0.46A2-0.24B2-0.24C2

方差分析結果由表可知，回归模型极显著，失拟项不显著，说明该模型与实验拟合较好。模型的R2Adj=0.9237，R2=0.9666，可以较好地说明肉桂精油、壳聚糖和葡萄籽提取物对综合得分的影响;由系数检验可知，一次项A和B、二次项A2、B2、C2以及交互项BC均极显著，肉桂精油、壳聚糖和葡萄籽提取物对湖羊肉的综合得分影响顺序为：肉桂精油（A）>壳聚糖（B）>葡萄籽提取物（C）。

2.2.2 两因素交互作用分析

根据回归方程作3D曲面图，考察其形状与颜色变化，分析肉桂精油、壳聚糖、葡萄籽提取物对于响应值的影响。

由图4-a可知，肉桂精油A和壳聚糖B两因子交互作用不显著。当肉桂精油的添加浓度在0.05%-0.1%范围内时，壳聚糖浓度在5-10mg/mL范围内，综合评价指标得分逐渐增大，直到肉桂精油的添加量为0.1%、壳聚糖的添加量为10mg/mL时，综合评价指标得分达到最高。继续加大肉桂精油和壳聚糖的浓度，则会使得综合评价指标得分降低。

由图4-b可知，肉桂精油A和葡萄籽提取物C两因子交互作用不显著。当肉桂精油的添加浓度在0.05%-0.1%范围内，葡萄籽提取物浓度在1-2mg/mL范围内，综合评价指标得分逐渐增大，直到肉桂精油的添加量为0.1%，葡萄籽提取物的浓度为2mg/mL时，综合评价指标得分达到最高。继续加大肉桂精油和葡萄籽提取物的浓度，则会使得综合评价指标得分降低。

由图4-c可知，壳聚糖B和葡萄籽提取物C两因子交互作用极显著。当壳聚糖的添加浓度在5-10mg/mL范围内，葡萄籽提取物浓度在1-2mg/mL范围内，综合评价指标得分逐渐增大，直到壳聚糖的添加量为10mg/mL，葡萄籽提取物的浓度为2mg/mL时，综合评价指标得分达到最高。继续加大壳聚糖和葡萄籽提取物的浓度，则会使得综合评价指标得分降低。

2.2.3 最佳配方的确定和验证

在单因素实验基础上，通过Box-Behnken实验设计优化得到复配保鲜剂的最佳配方为：肉桂精油0.12%、壳聚糖12.42mg/mL、葡萄籽提取物2.26mg/mL，综合得分理论值为8.675，为检验响应曲面法优化结果的可靠性，在4℃条件下对Box-Behnken实验设计优化得到的复配保鲜剂最佳配方做三个平行样贮藏8d的菌落总数和感官评分的综合得分验证，得到其实际值为8.554。这说明该模型对湖羊肉复合保鲜剂的配方进行优化是可行的，得到的工艺参数具有实际应用价值。

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