苗期注射接种法快速鉴定番茄青枯病抗性水平的研究

李林章，高天一，古斌权

（宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315040）

番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）是我国重要的蔬菜作物之一，据不完全统计，目前我国番茄种植面积将近133.3万hm2，其种植面积和产量均居世界首位；然而，在番茄长期连续地生产过程中，其土传病害的发生日趋严重。番茄青枯病是由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种世界范围内毁灭性的土传病害，在我国长江流域及其以南地区普遍发生，造成番茄大幅度减产，甚至绝收，经济损失巨大，严重威胁了我国番茄产业的健康可持续发展。目前，该病在生产中尚无较好的防治方法，选育抗病品种仍是最有效的解决途径[1]。

在番茄青枯病抗病育种过程中，材料的抗性鉴定和筛选是最为关键的环节。当前主要应用的抗性鉴定方法为田间自然鉴定和人工接种鉴定。田间自然鉴定是在创造利于发病的自然条件下进行田间鉴定的，而影响田间发病的因素很多，如气候条件、土壤环境及病原微生物数量等，该方法需要建立病圃、鉴定周期长、耗费人力大，结果不稳定，重复性差，不同年份鉴定结果经常存在差异。人工接种鉴定可以克服以上田间自然鉴定的不足，其环境条件相对可控，大大提高鉴定结果的稳定性和重复性，但目前常用的浸根法或伤根灌注法，对于大量的群体材料苗期抗性鉴定仍存在一些缺点，如幼苗接种后需二次重新种植、接种需要菌液量大，耗时费工，效率较低[2-4]。本试验拟通过注射接种法对番茄苗期青枯病抗性进行鉴定，并与传统伤根接种法比较，为番茄苗期青枯病抗性水平鉴定提供一种简便快捷的检测方法。

1 材料和方法

1.1 试验时间及地点

试验于2019年11月在宁波市高新农业技术实验园区玻璃温室及人工气候室进行。

1.2 试验材料

番茄鉴定材料：合作903（上海虹桥天龙种业有限公司）、桂砧1号（广西农业科学研究院蔬菜研究所）、TZ-1（宁波市农科院蔬菜研究所）。

青枯病病原：采集田间番茄青枯病自然发病株（宁波市鄞州区五乡镇番茄种植基地），并在实验室进行病原分离、培养和鉴定。

1.3 试验方法

1.3.1 番茄鉴定材料幼苗准备

选取番茄鉴定材料的健康种子若干，经浸种、催芽后，播种于经消毒灭菌的基质育苗盘，待幼苗1叶1心时，分苗至经消毒灭菌的50孔基质育苗穴盘中培养，每穴盘定苗30株，待幼苗生长至5～6片叶时接种。

1.3.2 青枯病病原菌液制备

将经实验室分离、培养、鉴定的青枯病菌株于TZC琼脂培养基上划线培养，于30 ℃条件下培养48 h，挑取单菌落转移至NA培养基平板培养，于30 ℃条件下培养 48 h，挑取单菌落用无菌水稀释成浓度分别为1×108cfu/mL、1×107cfu/mL、1×106cfu/mL的菌液备用。

1.3.3 病原菌接种方法

1.3.3.1 注射接种法 番茄幼苗生长至5～6片叶时接种。使用国标6号针头（对应内径为0.34 mm）注射器，吸取菌液若干。将针头对准幼苗第1节茎中部，沿茎斜下方向穿刺茎部后将针头退回至茎内部刺入点处，将菌液缓缓注入（待有菌液溢出即可），每株注射量约0.1 mL。

1.3.3.2 伤根接种法 将番茄幼苗从穴盘取出，经清水轻轻洗净根部，用剪刀剪掉根部1/3，然后再定植于经消毒灭菌的基质育苗穴盘中，同时将20 mL菌液倒入幼苗根部。

1.3.4 试验设计

注射接种法设置了3种不同的菌液浓度处理，分别为1×108cfu/mL（T1）、1×107cfu/mL（T2）、1×106cfu/mL（T3），以无菌水为空白对照（CK0），另以传统伤根接种法为接种方法对照，接种浓度为1×108cfu/mL。每个鉴定材料、每处理接种幼苗30株，3次重复。

1.3.5 抗性观测鉴定

接种后，将幼苗置于温度28～30 ℃，空气相对湿度70%以上的人工气候室进行培养，保持基质湿度60%左右。期间观测幼苗发病情况，于接种后第7、14天进行统计。

根据番茄青枯病病情分级标准确定0、1、2、3、4等5个发病等级，再根据发病株数及发病等级计算病情指数，最后根据发病率及病情指数确定鉴定材料青枯病抗性水平。病情分级标准为0级：无症状；1级：1片叶萎蔫；2级：2～3片叶萎蔫；3级：4片及以上叶萎蔫；4级：全株萎蔫或死亡。

计算公式为：发病率＝发病株数/接种总株数×100%；病情指数（DI）＝Σ（级数×发病株数）/（最高病情级数×总株数）×100。

抗性水平判定标准为抗（R）：0＜DI≤25；中抗（MR）：25＜DI≤50；中感（MS）：50＜DI≤75；感（S）：DI＞75。

2 结果与分析

2.1 不同材料、不同处理下番茄青枯病发病率及病情指数的鉴定结果

由表1数据可以看出，总体上，注射接种法与传统伤根接种法相比，青枯病发病病程明显加快，其发病程度明显加重，且3种不同材料、不同处理间表现趋势基本一致。试验中，在1×108cfu/mL相同接种浓度下，合作903、桂砧1号以及TZ-1注射接种法接种后第7天病情指数分别为60.0、60.8、58.3，明显高于传统伤根接种法接种后第7天病情指数（10.0、43.5、16.7）；注射接种法接种后第14天病情指数分别为83.3、75.0、60.0，传统伤根接种法接种后第14天病情指数分别为76.7、64.2、27.5，同样是前者高于后者。从结果可以看出，注射接种法可使病程变短，后期病情指数增加较慢，趋于稳定，而传统伤根接种法，发病病程较长，接种后第14天病情指数较接种后第7天病情指数明显增加。注射法直接将菌液注入植株茎部输导组织，减少了病原菌根部侵入及向上蔓延扩展过程，使得发病更加迅速，一般接种后第3天开始便有明显症状出现，至第7天，参试接种材料发病率即达到85%（T1）。不同接种浓度处理表明，随着注射接种菌液浓度的增加，其发病率及病情指数亦相应增加，且在3种不同番茄材料间表现出相同的规律。

2.2 注射接种法与伤根接种法鉴定结果的比较

传统伤根接种法一般以接种后第14天的发病结果作为评价材料抗性水平的依据[5]，本试验中，以传统伤根接种法，接种浓度为1×108cfu/mL，接种后第14天的病情指数鉴定结果为：合作903鉴定为感病（S），桂砧1号为中感（MS），TZ-1为抗病（R），其中合作903鉴定结果与杨琦凤等[6]报道结果相同，桂砧1号鉴定结果与郭堂勋等[2]报道结果相同。比较不同材料，不同接种浓度第7、14天的病情指数，结果表明，通过注射接种法（接种浓度为1×107cfu/mL）接种后第7天的病情指数与传统伤根接种法（接种浓度为1×108cfu/mL）接种后第14天的鉴定结果一致（除合作903外），说明注射接种法可以在更短的时间内对材料的抗性水平进行鉴定（表1）。

表1 不同品种、不同处理青枯病发病率及病情指数

3 小结与讨论

番茄青枯病是世界性的毁灭性病害，目前最为有效的途径仍是选育抗病番茄品种或嫁接砧木，其中对育种群体材料的抗性进行快速而准确的鉴定是提高抗病育种效率的关键[3]。青枯病抗性鉴定接种方法很多[5]，传统中仍以伤根接种法使用较多，认为接种效果稳定，鉴定结果可靠。本试验结果表明，通过注射接种法对番茄苗期青枯病抗性鉴定提供了可能性。青枯病病原菌侵染过程一般先附着于番茄根系表面，由根部伤口侵入皮层及维管束薄壁组织，逐渐沿木质部向上蔓延、扩展，在此过程中病原菌分泌产生胞外多糖蛋白等物质，引起导管堵塞，木质部水分运输功能减弱，使植株产生萎蔫症状[6]。 注射接种法直接将菌液接种于茎部输导组织，使其病程明显缩短，后期病情指数增加较慢，趋于稳定；因此，接种后第7天便可以统计抗性鉴定结果，本试验中，通过注射接种法（接种浓度为1×107cfu/mL）接种后第7天的病情指数与传统伤根接种法（接种浓度为1×108cfu/mL）接种后第14天的鉴定结果基本一致。

试验中，感病材料合作903的发病病程明显比抗病材料TZ-1快，抗病材料TZ-1在接种后第7天及第14天，其病情指数增加较感病材料合作903慢，推测抗病材料能一定程度地抑制病原菌在体内的增殖或限制病原菌活动功能，表现出延缓发病，但具体抗病机理有待于进一步研究证实[1]。

另外，注射接种法操作简单，接种效率高，与传统伤根接种法相比，可提高接种效率6～8倍；针尖细小，接种物理损伤小，本试验中空白对照无菌水接种，其材料均无明显发病症状，结果假阳性率低；直接注射，接种量小且易控制，需要菌液少，但接种后发病迅速，结果假阴性率亦低。接种浓度以及接种时期的选择是鉴定结果准确性的重要考虑因素，本试验在前期预试验基础上，以国标6号针头，接种浓度1×107cfu/mL，幼苗5～6片叶时为最为适宜。

注射接种法与传统伤根接种法比较，具有接种量小、接种效率高、鉴定时间短等诸多优点，非常适合作为抗病育种早期世代大量群体材料的苗期抗性快速鉴定筛选，淘汰早期感病材料。前人研究表明，番茄青枯病抗性遗传机制相当复杂，存在苗期抗性与成株期抗性不一致现象[5]，为确保鉴定结果的可靠性，对筛选的抗性材料可进行进一步成株期接种鉴定。