冠心平含药血清对氧化低密度脂蛋白诱导的RAW264.7巨噬细胞泡沫化的影响

周冠进，严 飞，孙玉婷，陈韦凯，掌琳惠，袁冬平，刘福明

(1.涟水县中医院，江苏 淮安 223400；2.南京中医药大学，江苏 南京 210023；3.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210023)

冠心平由黄精、当归、三七、瓜萎皮、甘松五味药组成，适用于气阴两虚、痰瘀互阻型稳定心绞痛，同时还可作为心肌梗死的辅助用药，改善预后。前期临床和动物实验结果表明，其具有调节血脂、抗血小板、抗血液黏稠度增高、抗氧化和保护血管内皮细胞功能等作用。

血液中的单核细胞在受到相关信号刺激后聚集到血管内壁，发育成为巨噬细胞，巨噬细胞吞噬并处理脂质；但当脂质水平过高、超过巨噬细胞的处理能力时，巨噬细胞产生泡沫化，进一步发展为泡沫细胞，使脂质在血管内壁不断堆积，加剧动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)疾病进程。因此，进一步研究冠心平对巨噬细胞泡沫化进程的调控将有助于AS的防治。

1 材料

1.1 药品和试剂 冠心平片(药物批准文号：苏药制字Z04000515；批号：1812008)，药片研磨成粉末后溶于蒸馏水并进行梯度稀释。DMEM培养基、胎牛血清：美国Gibco公司；青霉链霉双抗溶液：美国Thermo公司；磷酸盐缓冲液粉末：博士德生物工程有限公司；油红O粉末：北京索莱宝科技有限公司；游离胆固醇(free cholesterol，FC)检测试剂盒、胆固醇酯(cholesterol esterase，CE)检测试剂盒：南京建成生物工程研究所；TRIzol试剂：Invitrogen；DEPC水(批号 71027223)、Tris-EDTA缓冲液(批号 69097422)：Biosharp；三氯甲烷(批号 20130916)：上海凌峰化学试剂有限公司；异丙醇(批号 20190227)、无水乙醇(批号 20190920)：国药集团化学试剂有限公司；5X All-In-One逆转录试剂盒(G490)、EvaGreen 2X qPCR MasterMix-Low ROX试剂盒(Master Mix-LR)：Abm；PCR引物：上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 仪器 NanoDrop One微量紫外-可见光分光光度计、Revco ULT超低温冰箱、Heraeus Multifuge X1R离心机：美国Thermo Fisher公司；Infinite M200PRO 多功能酶标仪：瑞士TECAN公司；5417R高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；Veriti 96-Well Thermal Cycler梯度PCR仪、7500荧光实时定量PCR仪：美国Applied Biosystems公司。

2 方法

2.1 冠心平含药血清获取 冠心平片按标示量研磨成粉末，蒸馏水溶解，4 ℃保存，使用前37 ℃水浴温热。12只SD大鼠[180～200 g，雄性，SPF级，合格证号为1103241911006182，生产许可证号为SCXK(京)2016—0002]，购自青龙山实验动物繁殖场，饲养于南京中医药大学实验室。适应性喂养3 d后，将大鼠分为空白组、冠心平低剂量组(0.405 g/kg)、冠心平中剂量组(0.810 g/kg)、冠心平高剂量组(1.620 g/kg)，每组3只。冠心平各剂量组连续4 d灌胃给药，空白组给予蒸馏水，末次给药1 h后，戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉采血，血液于室温静置2 h，3 000 r/min离心10 min，分离血清，血清56 ℃热灭活30 min，0.22 μm滤膜过滤除菌后于-80 ℃分装保存备用。

2.2 RAW264.7巨噬细胞培养 细胞复苏：冻存的巨噬细胞于37 ℃水浴中迅速解冻，将细胞转移到装有2 mL全血清培养液的15 mL离心管。800 r/min离心5 min后弃上清，加入1 mL全血清培养液重悬混匀后加入培养皿，摇匀。在37 ℃、5% CO细胞培养箱内培养，第2天更换培养基，细胞生长到对数生长期进行传代。

细胞传代：吸取一部分培养基，用剩余培养基将贴壁细胞吹落，置于显微镜下摇晃观察；将含有细胞的培养基吸入15 mL至离心管，离心，贴好封口膜，离心条件为25 ℃、800 r/min、5 min；离心结束后，弃去上清，向细胞沉淀中加入1 mL全血清培养液重悬，吹匀；将吹匀的1 mL细胞分别加入培养皿中，并加入新鲜全血清培养液8 mL，混匀。放入37 ℃、5% CO培养箱进行培养。

2.3 巨噬细胞泡沫化 取RAW 264.7细胞悬液，调整密度为1.0×10/mL，接种于含培养基的24孔板中，每个孔接种1 mL(含100 μL冠心平各剂量组含药血清)，细胞分为空白组，模型组，冠心平含药血清低、中、高剂量组，贴壁培养12 h，吸除原培养基，除空白组外，其余各组加入氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)80 μg/mL诱导巨噬细胞泡沫化，作用24 h。

2.4 油红O染色RAW264.7细胞 取RAW264.7细胞悬液，调整密度为1.0×10/mL，接种于含培养基的24孔板中，每个孔接种1 mL，细胞分为空白组，模型组，冠心平含药血清低、中、高剂量组，贴壁培养12 h，吸除原培养基，除空白组外，其余各组加入ox-LDL(80 μg/mL)诱导巨噬细胞泡沫化，作用24 h，空白组和模型组加入新鲜全血清培养液，药物干预组加入高、中、低剂量的冠心平含药血清作用于细胞，24 h后进行油红O染色。

2.5 巨噬细胞胆固醇水平检测 RAW264.7巨噬细胞接种于6孔板，每孔接种2 mL，将细胞密度调整为每孔1×10，贴壁12 h，次日早上吸走原培养基，除了空白组加入新鲜全血清培养液，其余各组给予ox-LDL(80 μg/mL)，刺激细胞24 h后，药物组加入10%不同浓度冠心平含药血清作用于细胞，作用24 h后按试剂盒说明书测定胆固醇水平，包括FC与CE。

2.6 实时荧光定量PCR法检测巨噬细胞清道夫受体A(scavenger receptor-A，SR-A)与CD36 mRNA表达水平 TRIzol法提取细胞RNA。细胞培养于6孔板，药物处理结束后弃去培养上清，1 mL TRIzol试剂加入细胞中，充分吹打，收集溶液于离心管内，12 000 r/min，4 ℃高速离心，收集上清，用三氯甲烷去除苯酚等有机相后，加入异丙醇将RNA与水相分离，获得RNA沉淀。75%乙醇清洗RNA后控干，DEPC水溶解。微量紫外分光光度计检测RNA浓度，用DEPC水将RNA定量为10 ng/μL。按试剂说明书要求加入预混的逆转录试剂和RNA，用梯度PCR仪将RNA逆转录为互补DNA(cDNA)。选用特异性PCR扩增引物，根据实时荧光定量PCR试剂盒说明书要求，使用Thermo Fisher 7500实时荧光定量PCR仪进行扩增反应。mRNA相对表达量通过2-ΔΔ法计算，内参基因为GAPDH。

3 结果

3.1 冠心平含药血清减少巨噬细胞的泡沫化 与空白组相比，模型组巨噬细胞大量红染脂滴，代表泡沫化程度明显；与模型组比较，冠心平含药血清低、中、高剂量组均减轻了巨噬细胞泡沫化情况，其中尤以中、高剂量组效果最为明显。见图1。

图1 冠心平含药血清对巨噬细胞泡沫化的影响(油红O染色，10×20倍)

3.2 冠心平含药血清调节巨噬细胞胆固醇水平 与模型组比较，冠心平含药血清低剂量组巨噬细胞FC水平显著增加(

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05)；冠心平含药血清高剂量组巨噬细胞CE水平显著降低(

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05)。见表1。

表1 冠心平含药血清对巨噬细胞胆固醇水平的影响

3.3 冠心平含药血清增加泡沫细胞相关因子表达水平 与模型组比较，冠心平含药血清高剂量组SR-A mRNA表达水平显著增加(

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05)；冠心平含药血清低、中、高剂量组CD-36 mRNA表达水平均显著增加(

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05)。见表2。

表2 冠心平含药血清对巨噬细胞SR-A与CD36 mRNA表达水平的影响

4 讨论

巨噬细胞泡沫化是AS形成的一个重要因素，巨噬细胞内脂质过量积累是形成泡沫细胞的重要原因，巨噬细胞泡沫化会引发相关的炎症反应，进一步加重AS病理进程，因此抑制巨噬细胞泡沫化并减轻由此引发的炎症反应对防治AS具有积极作用。

巨噬细胞向泡沫细胞的转化是以细胞内脂质大量沉积为特点的，ox-LDL常被用于诱导巨噬细胞泡沫化。本研究选用ox-LDL处理巨噬细胞24 h以造成巨噬细胞泡沫化模型，观察不同浓度冠心平含药血清在这一过程中的影响。

油红O染色结果显示，ox-LDL处理增加了泡沫细胞的形成，表明巨噬细胞泡沫化模型构建成功。进一步加以不同浓度的冠心平含药血清干预后，泡沫细胞的形成减少，以中、高浓度较为明显。实验结果表明，冠心平含药血清能够对巨噬细胞泡沫化产生一定的抑制作用，并且具有一定的剂量依赖性。

在巨噬细胞泡沫化进程中，巨噬细胞对脂质的处理能力减弱，脂质在细胞内不断堆积，进而加剧泡沫化的发生。FC与CE属于脂质中的胆固醇，是胆固醇的两种存在形式，其水平的增加意味着巨噬细胞更易于泡沫化以及泡沫化进程的加快。本研究结果表明，冠心平低剂量含药血清增加细胞FC含量，但中、高剂量含药血清则不具有增加FC水平的作用。此外，高剂量含药血清降低了CE水平，减少了细胞的CE脂质含量。实验结果表明，冠心平含药血清对于不同类型的胆固醇可能存在不同的调节作用。冠心平对于FC的升高作用和对于结合形式的CE的降低作用，表明其对于CE的形成过程存在抑制作用，但这需要进一步的实验验证。

巨噬细胞在泡沫化过程中，SR-A的表达水平增加与巨噬细胞摄取ox-LDL相关。研究结果表明，高剂量冠心平含药血清显著增加了SR-A mRNA的表达，这提示冠心平含药血清增加了巨噬细胞对ox-LDL的摄取。此外，对CD36的检测则表明冠心平含药血清低、中、高剂量均可增加CD36 mRNA的表达水平。SR-A与CD36的表达增加提示巨噬细胞摄取了更多的ox-LDL，意味着巨噬细胞更易于发展成为泡沫细胞，但油红O染色的结果又与此推论相反。由此，笔者推测冠心平含药血清在巨噬细胞处理脂质的环节发挥了重要作用，冠心平含药血清很有可能增强了巨噬细胞对脂质的分解，使得巨噬细胞对外界脂质的摄取能力增强却又不加剧自身向泡沫化的转变，事先对环境中脂质的调节及对自身的调节。同时，这也使得冠心平含药血清增加FC却减少CE水平这一实验结果易于理解。

综合实验结果来看，冠心平含药血清能够抑制巨噬细胞的泡沫化，但这一功能的发挥可能并不是常规直接减少巨噬细胞对脂质的摄取，其中更可能涉及巨噬细胞对脂质的处理。