软肝饮对HBV转基因小鼠HBV-DNA、肝纤维化四项指标及炎症细胞因子表达的影响

施 美，侯 勇，周 灏，刘丽丽，张先姚，张国梁

(1.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031；2.安庆市中医院，安徽 安庆 246000)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染呈世界流行性。据WHO报道，全球约有2.57亿慢性HBV感染者。全球每年约有88.7万人死于HBV感染相关疾病，其中肝硬化占30%，原发性肝癌占45%。在中国所有肝硬化和原发性肝癌患者中，由HBV感染所致者分别占77%和84%。慢性乙型病毒性肝炎的治疗目标是最大限度地长期抑制HBV复制。目前抗病毒药物主要有核(苷)酸类似物和干扰素，两者有其各自的优缺点。近年来，随着对中医药研究的不断深入，研究者发现中医药在慢性乙型病毒性肝炎的治疗中发挥着重要的特色与优势。软肝饮是基于长期临床经验和实验研究结果的自拟中药复方，可有效治疗慢性乙型病毒性肝炎。研究发现，软肝饮在降低HBV转基因小鼠HBV-DNA含量，改善层黏连蛋白(laminin，LN)、透明质酸(haluronic acid，HA)、Ⅳ型胶原(collage type Ⅳ，Ⅳ-C)、Ⅲ型前胶原(procollagen type Ⅲ，PCⅢ)水平，调控白细胞介素2(interleukin-2，IL-2)、白细胞介素4 (interleukin-4，IL-4)、白细胞介素10 (interleukin-10，IL-10)、干扰素γ(interferon γ，IFN-γ)水平方面有一定作用，现报道如下。

1 材料

1.1 实验动物 50只SPF级BALB/c品系HBV转基因小鼠(雌雄各半，35～40日龄，体质量18～25 g)、10只与HBV转基因小鼠同窝的非HBV转基因正常小鼠(雌雄各半，35～40日龄，体质量18～25 g)：购自中国人民解放军第458医院全军肝病中心[生产许可证号：SCXK(军)2017—0016]。将小鼠饲养于安徽中医药大学第一附属医院动物房(普通级饲养室)，在开始正式实验前小鼠先适应性饲养1周，观察小鼠的各项情况。实验小鼠的饲养条件严格按照《实验动物管理条例》实行，每笼5只，雌雄分笼饲养，使用独立的通气设备，相对湿度为40%～60%，饲养温度为22～24 ℃，每日24 h中，其中12 h光照环境，另外12 h黑暗环境。每3 d更换一次饲料和水，所有的笼具及垫料均作灭菌处理后使用。对于死亡小鼠及时查明死因，然后按相关要求妥善处理。

1.2 药物与试剂 软肝饮(丹参、黄芪各30 g，醋鳖甲20 g，赤芍15 g，莪术、柴胡、炒白术各10 g，三七、五味子各5 g)由安徽中医药大学第一附属医院中药房提供，煎药室煎制，浓度为2 g/mL。恩替卡韦分散片(每片0.5 mg，批号 197073108)：安徽贝克药业有限公司。

小鼠IL-4 ELISA试剂盒(KS11806&08/2019)、小鼠IL-10 ELISA试剂盒(KS10138&08/2019)、小鼠IL-2 ELISA试剂盒(KS12106&08/2019)、小鼠IFN-γ ELISA试剂盒(KS10967&07/2019)：科顺生物；EZ-10 Total RNA Mini-Preps Kit(B618583)：Sangon Biotech；ABScript Ⅱ RT Master Mix for qPCR with gDNA Remover(RK20403)：ABclonal；TB GreenPremix Ex TaqⅡ (Tli RNaseH Plus)(RR820A)：TAKARA。

1.3 实验仪器 酶标仪(BioRad 680)、常规PCR仪(Mycycler)、real-time PCR仪(IQ5)：BioRad；分光光度仪(754PC)：上海菁华。

2 方法

2.1 分组及给药方法 将50只HBV转基因小鼠随机分为软肝饮高剂量组、软肝饮中剂量组、软肝饮低剂量组、恩替卡韦组、模型组，每组10只，另选取10只正常小鼠作为空白对照组，均饲养于安徽中医药大学第一附属医院动物房(普通级饲养室)，实验前先适应性饲养1周。每天分别给药1次。连续4周。软肝饮高剂量组小鼠每只灌胃0.4 g(相当于临床用量9倍)，软肝饮中、低剂量组小鼠每日分别灌胃0.2、0.1 g，3组小鼠每日灌胃容积均为0.2 mL。恩替卡韦组以恩替卡韦分散片0.5 mg溶于77 mL生理盐水中，每日按0.2 mL剂量灌胃。模型组及空白对照组以生理盐水每日0.2 mL灌胃。各组小鼠自由饮水，每日进食相等，均在相同环境下饲养。

2.2 标本采集及监测方法 治疗4周后，采用实时荧光定量PCR技术检测外周血及肝组织中HBV-DNA表达水平，采用ELISA方法检测小鼠血清LN、HA、Ⅳ-C、PCⅢ、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的水平。

3 结果

3.1 各组小鼠血清和肝组织HBV-DNA表达水平比较 与模型组比较，软肝饮高、中、低剂量组和恩替卡韦组小鼠血清和肝组织中HBV-DNA表达水平明显降低，差异有统计学意义(

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05)；软肝饮的作用呈明显的剂量依赖性(

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05)。见表1。

表1 各组小鼠血清和肝组织中HBV-DNA表达水平比较

3.2 各组小鼠血清肝纤维化四项指标表达水平比较 与空白对照组比较，模型组小鼠血清LN、HA、Ⅳ-C、PCⅢ表达水平显著升高(

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05)；与模型组比较，软肝饮高剂量组和恩替卡韦组LN、HA、Ⅳ-C、PCⅢ表达水平显著降低(

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05)；软肝饮降低血清LN、HA、Ⅳ-C的作用呈剂量依赖性(

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05)。见表2。

表2 各组小鼠血清LN、HA、Ⅳ-C、PCⅢ水平比较

3.3 各组小鼠血清IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ水平比较 与空白对照组比较，模型组IL-2、IL-10、IFN-γ水平显著降低(

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05)，IL-4水平显著升高(

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05)；与模型组比较，软肝饮高、中剂量组和恩替卡韦组IL-4水平显著降低(

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05)，IL-2、IL-10、IFN-γ水平显著升高(

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05)；与软肝饮低剂量组比较，软肝饮高、中剂量组IL-4水平显著降低(

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05)，IL-10水平显著升高(

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05)。见表3。

表3 各组小鼠血清IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ水平比较

4 讨论

HBV感染呈世界流行性，会引发全球严重的健康问题。近年来，随着抗病毒药物的广泛应用，HBV-DNA得到了有效控制，但距离临床治愈仍有漫长的路程。现代诸多研究发现，HBV感染后肝细胞出现损伤并不是由病毒直接引起的，而是由于此种抗原引起宿主的免疫细胞发生免疫应答所致。宿主感染HBV后，各淋巴细胞亚群数目和功能发生改变，这就表明机体外周血淋巴细胞亚群间的平衡被打破，机体的免疫状态可能发生紊乱。所以，在HBV感染后，宿主将启动适应性免疫应答和非适应性免疫应答以达到清除病毒的目的。

HBV感染可归属于中医学“胁痛”“黄疸”“积聚”“鼓胀”等疾病范畴。邪气入侵是其发病的外在因素，正气不足是发病的内在条件，邪气主要包括湿热、疫毒、瘀血等，正气不足主要是指脾气亏虚、肾气不足等，发病过程中常常虚实错杂。对HBV感染的治疗，中医主张辨证论治，肝气郁结者应疏肝理气，肝胆湿热者应清利湿热，脾失健运者应益气健脾，瘀血阻络者应活血化瘀，肝肾阴虚者则滋肾益肝，脾肾阳虚者应温补脾肾，其中证型相兼者应将上述治法联合运用。中医药治疗慢性乙型病毒性肝炎的作用机制不在于直接杀灭病毒，而是通过发挥中药方剂的整体效应以调整机体的免疫状态，从而达到间接杀灭病毒的目的。

慢性肝炎随着病情进展会经历肝纤维化至肝硬化，肝纤维化是可逆转的，早期诊治肝纤维化，可以避免肝硬化并发症的发生。血清“肝纤维化四项”(HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ)是目前临床上方便可靠的检测肝纤维化的指标。HA由间质细胞合成，经淋巴入血，由肝窦内皮细胞摄取并降解，当肝脏受损后，HA水平升高。当肝脏发生纤维化后LN会大量沉积在肝窦内皮细胞间隙，降低内皮细胞的通透性，肝纤维化程度越重，则LN水平越高，两者呈正相关。Ⅳ-C、PCⅢ也是肝纤维化的指标之一。近年来，肝纤维化的研究也成为临床研究热点。刘雯等强调中医药在肝纤维化的治疗中发挥着重要的作用，其团队通过研究发现恩替卡韦联合扶正化瘀胶囊有助于提高肝郁血瘀型慢性乙型病毒性肝炎患者HBeAg转阴率、HBV-DNA快速应答率，并在肝功能改善和抗肝纤维化方面均有较好作用，为中医药在肝纤维化治疗方面提供了有效证据。

HBV感染后导致慢性乙型病毒性肝炎的发病与机体免疫功能特异性损伤相关。在HBV感染的过程中，多种炎症因子参与其中，影响着疾病的预后和进展。IL-2是HBV感染过程中重要的炎症因子之一，既往研究发现，通过有效的保肝抗病毒后，IL-2水平较治疗前显著提高，提示IL-2水平与HBV感染者的结局和预后有关。研究发现，IL-4与HBsAg、DNA和谷氨酸氨基转移酶呈正相关，免疫清除期患者治疗后IL-4水平较治疗前明显下降，提示IL-4参与肝细胞的炎症、纤维化等过程。IL-10作为一种重要的免疫抑制炎症因子，在HBV感染的免疫耐受中起着重要作用，当感染HBV后，患者免疫功能紊乱，导致T细胞刺激后产生大量的IL-10，从而促进肝细胞出现炎症、坏死、增生。IFN-γ是由活化的T细胞和自然杀伤细胞产生的，参与介导体内炎症反应。研究发现，慢性乙型病毒性肝炎患者抗病毒治疗过程中，血清IFN-γ水平逐渐升高，且IFN-γ水平与HBV-DNA水平呈负相关，提示IFN-γ水平升高可能与HBV抑制甚至清除积极相关，进一步佐证了IFN-γ可以通过刺激机体免疫应答达到抗病毒的目的。慢性乙型病毒性肝炎的发病多与湿热瘀毒有关，其中正气亏虚是发病的基础，湿热瘀毒是发病的条件，正气亏虚、瘀血内结是其病机所在，故创立软肝饮，旨在益气健脾、化瘀软坚。软肝饮全方由丹参、赤芍、醋鳖甲、黄芪、莪术、柴胡、炒白术、三七、五味子共9味药物组成。方中丹参、醋鳖甲为君药，有祛瘀软坚之功。莪术、三七、赤芍破血行气化瘀；黄芪、炒白术益气健脾，柴胡疏肝理气，五味子益气生津、补肾宁心，全方共奏活血化瘀、益气健脾之效。既往临床研究发现，软肝饮能明显改善慢性乙型病毒性肝炎患者乏力、纳差、肝区疼痛等不适，降低肝功能异常指数等，同时对特异性免疫指标有一定的影响，发挥协同西药增强抗病毒作用。实验研究发现，软肝饮大、小剂量组可明显降低人血清白蛋白诱导的免疫性肝纤维化大鼠模型血清HA、LN、PCⅢ的含量，同时可降低大鼠肝脏中羟脯氨酸的含量，从而证实软肝饮通过对肝脏胶原物质代谢的影响而产生抗肝纤维化的治疗作用。近年来的动物实验研究表明，中药软肝饮高剂量能够明显降低HBV转基因小鼠血清学生化指标谷氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、总胆红素的水平。

本次研究结果显示，治疗后软肝饮高剂量组及恩替卡韦组HBV转基因小鼠血清和肝组织中HBV-DNA含量明显降低，治疗后软肝饮高剂量组和恩替卡韦组LN、HA、Ⅳ-C水平低于模型组；HBV转基因小鼠模型组IL-2、IL-10、IFN-γ水平明显降低，而IL-4水平明显升高，治疗后软肝饮高、中剂量组以及恩替卡韦组IL-10水平明显升高，IL-4水平明显降低。结果表明，软肝饮治疗HBV转基因小鼠发挥抗病毒及抗纤维化的作用机制可能与调控炎症细胞因子有关。