养阴活胃合剂对慢性萎缩性胃炎大鼠血清胃蛋白酶原和胃组织水通道蛋白的影响

马慧娟，谢姗珊，曙阿克·哈尔恒，曾斌芳

(新疆医科大学，新疆维吾尔自治区 乌鲁木齐 830000)

慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)，多由脾升胃降功能失调，运化失司，脾胃虚弱，痰气瘀交阻于胃脘所致，多呈虚实夹杂、寒热并见之势。其特征是胃黏膜萎缩，胃酸分泌减少，胃黏膜病理改变以及肠腺上皮化生，而具有广泛肠腺上皮化生的严重胃炎是胃癌的主要危险因素。目前，西医多以抗炎为主，但预后较差，CAG易复发。中医学非常重视“胃气”，认为“人以胃气为本”，主张标本兼治，在治疗CAG上有显著疗效。养阴活胃合剂对CAG患者具有较好的疗效，可迅速改善临床症状，逆转胃黏膜的病理状态，使黏膜腺体排列整齐，使腺体与胃小凹固有层厚度正常，减轻胃窦部炎症细胞浸润。

1 材料

1.1 实验动物 66只6～8周龄SPF级SD雄性健康大鼠，体质量180～200 g，由新疆医科大学动物实验中心[生产许可证号：SCXK(新)2018—0002]提供。饲养于新疆医科大学动物实验中心SPF级屏障实验室，相对湿度40%～55%，室温(23±2)℃，运用12 h光暗周期循环，常规标准饲料喂养。

1.2 药物与试剂 养阴活胃合剂中药免煎颗粒购买于江阴天江药业有限公司，由芦根30 g，海螵蛸20 g，旋覆花12 g，麸炒白术、茯苓各10 g，炒鸡内金、醋莪术各9 g，炒牡丹皮、制远志、砂仁、炙甘草各6 g组成。

氨水(C10923265)：麦克林有限公司；脱氧胆酸钠(407H021)：北京索莱宝科技有限公司；胃复春片(19066206)：杭州胡庆余堂药业有限公司；大鼠胃蛋白酶原Ⅰ(pepsinogen Ⅰ，PGⅠ)酶联免疫吸附测定试剂盒(JL21317)、大鼠胃蛋白酶原Ⅱ(pepsinogen Ⅱ，PGⅡ)ELISA试剂盒(JL21318)：江莱生物；DAB显色试剂盒(2024G0518)、兔二步法试剂盒(2023C0819)：中杉金桥；逆转录试剂盒(RR047A)、荧光定量PCR试剂盒(AK31129A)：Takara。

1.3 主要仪器 全波长酶标仪(Multiskan GO)：Thermo Fisher；低温高速台式冷冻离心机(3-30K)：Sigma；电热恒温培养箱(DHP-9082)：上海一恒科学有限公司；荧光定量PCR仪(Quant Studio 6 Flex)：Applied biosystems。

2 方法

2.1 模型复制和给药 参考文献[8]方法并加以改良，运用综合方法复制CAG大鼠模型。将66只SPF级SD雄性大鼠适应性喂养1周后，按体质量分为正常组11只，其余55只用于复制CAG模型。模型复制方法：给予大鼠0.1%氨水，让其自由饮用。模型复制第1～9周，每周三、周六采用10%乙醇给予大鼠灌胃，剂量为5 mL/kg；第10～12周，每周三、周六采用30%乙醇灌胃，剂量为5 mL/kg。模型组每周除周三、周六外，采用20 mmol/L脱氧胆酸钠灌胃，剂量为5 mL/kg。每2 d禁食1 d，不禁水。正常组大鼠给予常规饮水和饲料。模型复制第4、8、12周，随机抽取1只大鼠进行胃黏膜病理检查，确定模型复制成功后，将其随机分为模型组，养阴活胃合剂高、中、低剂量组，胃复春组，每组10只。养阴活胃合剂低、中、高剂量组分别按60 kg成人临床剂量的2.7、5.4、8.1倍给予养阴活胃合剂免煎剂0.84、1.68、2.52 g/(kg·d)。对照组按60 kg成人临床剂量的5.4倍给予胃复春1.44 g/(kg·d)灌胃，共8周。模型组按1.5 mL/d给予无菌水灌胃。实验过程中，因灌胃不当致大鼠死亡2只，不明原因死亡5只。

2.2 标本采集 末次给药结束，禁食不禁水24 h后，称质量，给予10%水合氯醛35 mL/kg进行皮下麻醉后，备皮，进行食管导管插管。同时腹主动脉采血，4 ℃冰箱过夜后，3 500 r/min离心15 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱。沿腹剪开，将胃组织与其他组织轻轻分离，同时在近幽门处剪开插入另一导管。用止血钳和手术缝合线结扎幽门和贲门，从插管处匀速注入5 mL蒸馏水至胃腔，再从幽门端导管处，收集胃液15 mL至离心管中，再以4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取其上清液至新的EP管中。移液过程中，每个样本先取一滴胃液用pH试纸测试胃液pH值，快速读取，详细记录后，将胃液冻存至-80 ℃冰箱。同时取全胃，用生理盐水冲洗，滤纸吸干，做大体观察，称质量并记录。每个样本沿胃窦部、胃底部各取1 cm×0.5 cm组织条两块，取胃窦部和胃底部各一块组织条放入用铅笔标记好号码的包埋盒中，再用4%多聚甲醛组织固定液固定72 h；其余大鼠组织块和组织条放入标记好的冻存管中，迅速存入液氮中，以备后续实验。

2.3 观察指标及方法

2.3.1 一般指标观察 实验过程中，观察各组大鼠鼻舌、爪甲、肛门、皮毛变化，饮食、饮水情况，大便性状、气味改变，日常精神动态等，并在每周三称体质量。

2.3.2 胃分泌指标检测 采用广泛试纸法测试胃液pH值，采用酸碱滴定法测定胃液总酸度。

2.3.3 酶联免疫吸附法测定大鼠血清PGⅠ、PGⅡ水平 取出实验所需试剂盒和大鼠血清，按照20∶1的比例配置洗涤液，并按试剂盒说明书进行操作。各孔相应加入同容积上样液50 μL，标准品孔加不同梯度浓度的标准品(PGⅠ：2、4、8、16、32、64 ng/mL；PGⅡ：0.5、1、2、4、8、16 ng/mL)，空白孔设一复孔加入样本稀释液，样本孔加入各样本。再加入100 μL HRP标记的待检测抗体，封板膜正确封孔，37 ℃恒温箱孵育1 h。甩掉反应液，滤纸拍干，每孔加350 μL洗涤液，静置1 min，重复洗板5次。各孔加底物A、B各50 μL，锡纸包盖，37 ℃恒温箱孵育15 min。再加50 μL终止液，快速使用酶标仪测定出450 nm波长处各孔光密度值，制作大鼠血清PGⅠ标准品线性回归曲线，计算大鼠血清PGⅠ和PGⅡ蛋白浓度，并计算其胃蛋白酶原比值(pepsinogen ratio，PGR)，即PGⅠ/PGⅡ比值。

2.3.4 采用RT-qPCR法检测胃组织水通道蛋白(aquaporin，AQP)1、AQP3和AQP4 mRNA表达水平 取出大鼠组织冻存管，置于冰上，用无菌剪刀剪出约0.1 g胃组织，研磨钵中倒入液氮，快速研磨成干粉状，装入已经标记好的加有Trizol的无酶EP管中，冰上裂解10 min。氯仿分层，4 ℃下12 000 r/min离心15 min，用同容积异丙醇沉淀RNA，加入75%乙醇1 mL以清洗RNA沉淀，弃去乙醇，晾干，再加入相应的无酶水溶解RNA，在A/A上，检测并确定RNA纯度和浓度。严格按照逆转录试剂盒步骤，去除基因组DNA，反转录合成cDNA，放置-80 ℃保存。严格遵照PCR试剂盒说明书配置PCR反应体系，上机进行扩增。各目的蛋白的引物由上海生工设计生产，引物序列见表1。采用2-ΔΔ法计算目的基因的相对表达水平。ΔΔ

C

=(

C

-

C

)-(

C

-

C

)。

表1 各检测指标引物序列

3 结果

3.1 各组大鼠一般状况比较 实验过程中，正常组大鼠饮食、饮水量较其他组增多，喜动好斗，毛色白而顺滑，而模型组大鼠喜聚集，喜静卧，活动减少，部分大鼠后腿发软，毛色黄且脱落较多，舌质淡白，偶有紫暗，爪甲淡白，肛周污染，大便呈黑褐色，偶有大便不成形，气味臭秽，兼见大便时有溏泄；经治疗后，养阴活胃合剂高、中、低剂量组和胃复春组大鼠毛发脱落减轻，活动量适中，饮食、饮水量较前增加，无溏泄。

3.2 各组大鼠体质量比较 给药0 d时，与正常组比较，各给药组大鼠体质量显著降低(

P

<0

.

05)。给药4周后，与正常组比较，模型组大鼠体质量显著减少(

P

<0

.

05)；与模型组比较，养阴活胃合剂低、中、高剂量组和胃复春组大鼠体质量均显著升高(

P

<0

.

05)。给药8周后，与正常组比较，模型组大鼠体质量显著降低(

P

<0

.

05)；与模型组比较，各给药组大鼠体质量均显著升高(

P

<0

.

05)。见表2。

表2 不同时点各组大鼠体质量比较

3.3 各组大鼠胃液pH值和总酸度比较 与正常组比较，模型组大鼠胃液pH值显著升高(

P

<0

.

05)，总酸度显著降低(

P

<0

.

05)。与模型组比较，各给药组大鼠胃液pH值均显著降低(

P

<0

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05)，总酸度显著升高(

P

<0

.

05)。与养阴活胃合剂低剂量组比较，养阴活胃合剂中、高剂量组和胃复春组胃液总酸度升高(

P

<0

.

05)。见表3。

表3 各组大鼠胃液pH值和总酸度比较

3.4 各组大鼠血清PGⅠ、PGⅡ水平和PGR比较 与正常组比较，模型组大鼠血清PGⅠ水平和PGR降低，PGⅡ水平升高(

P

<0

.

05)。与模型组比较，各给药组大鼠血清PGⅠ水平和PGR均升高(

P

<0

.

05)，养阴活胃合剂中、高剂量组和胃复春组PGⅡ水平降低(

P

<0

.

05)。与养阴活胃合剂低剂量组比较，其余给药组的PGⅠ水平和PGR升高，PGⅡ水平降低(

P

<0

.

05)。见表4。

表4 各组大鼠血清PGⅠ、PGⅡ和PGR水平比较

3.5 各组大鼠胃组织AQP1、AQP3、AQP4 mRNA相对表达水平比较 与正常组比较，模型组大鼠胃组织AQP1 mRNA表达水平显著升高(

P

<0

.

05)，AQP3、AQP4 mRNA表达水平显著降低(

P

<0

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05)。与模型组比较，各给药组AQP1 mRNA表达水平显著降低(

P

<0

.

05)；养阴活胃合剂低、中剂量组和胃复春组AQP3 mRNA表达水平显著升高(

P

<0

.

05)，养阴活胃合剂中、高剂量组和胃复春组AQP4 mRNA表达水平显著升高(

P

<0

.

05)。见表5。

表5 各组大鼠AQP1、AQP3、AQP4 mRNA相对表达水平比较

4 讨论

CAG可归属于中医学“痞满”范畴。张仲景提出外感病下之过早致脾胃损伤，正虚邪陷，中焦气机升降失常可致痞的病机。至李东垣进一步阐明脾虚湿困、湿阻中焦、脾胃虚弱等均可致痞满。CAG多由脾胃升降功能失调，运化失司，脾胃虚弱，痰瘀交阻于胃脘所致，多呈虚实夹杂、寒热并见之证。又如《兰室秘藏》曰：“或多食寒凉，及脾胃久虚之人，胃中寒则胀满，或脏寒生满病。”

叶天士《临证指南医案》云：“太阴湿土，得阳始运；阳明燥土，得阴自安。”脾以升为健，胃以降为和，以达到脾胃以平为期的生理状态。养阴活胃合剂中，芦根性甘、味寒，归肺、胃经，功能清热除烦、生津止呕、利尿，既可养阴，又可用于和胃降逆，故为君药；臣药配伍莪术、牡丹皮、海螵蛸，取其行气止痛、消食化积、和胃止痛止血之功，白术、茯苓益气健脾，化湿助运；佐以旋覆花、炙远志疏肝健脾，化痰通络，鸡内金、砂仁健脾和胃，消食化积，炙甘草为方中使药，调和诸药。《医学衷中参西录》：“鸡内金，鸡之脾胃也，善化瘀积。”中焦脾胃，脾升胃降，运化水谷精微，若中焦气机不利，气化受阻，升降失调，故而出现脘痞胀满、不思饮食之症。白术与鸡内金同用，可化瘀消积，更能健脾益胃，脾胃强健则气机条畅，消积化滞。《医学衷中参西录》指出：“炙远志若以炙甘草辅之……入胃又能助生酸汁，使人多进饮食，和平纯粹之品，固无所不宜也。”莪术配伍茯苓、白术等健脾补气之剂，可改善脾胃虚弱运化乏力之脘痞胀满、不思饮食等证。

研究表明，中药可以改善动物组织的分泌功能，有调节胃酸分泌的作用。胃黏液量的变化、胃酸的增减、幽门螺杆菌感染和胃蛋白酶活力的变化均影响胃分泌功能。而改善胃分泌功能则能有效防治幽门螺杆菌感染，改善胃内环境。目前，胃功能检测被广泛运用在胃癌的早期诊断中，对于临床诊疗发挥重要作用。

各给药组CAG大鼠胃液pH值均明显降低，胃液总酸度显著升高，且养阴活胃合剂高、中剂量和胃复春降低胃液pH值和升高胃液总酸度的作用优于养阴活胃低剂量组。各给药组大鼠血清PGⅠ表达水平显著升高，PGⅡ水平降低，PGR明显升高。研究结果表明，养阴活胃合剂通过上调PGⅠ表达水平和PGR改善CAG大鼠胃黏膜功能状态，以达到治疗CAG的目的。且经各给药组干预后，大鼠体质量也有明显回升。大鼠胃黏膜细胞内渗透压增加，诱导AQP3、AQP4表达水平升高，转运细胞间隙水至黏膜细胞，导致胃黏膜充血、水肿，提示CAG是因为大鼠胃黏膜炎症细胞浸润，细胞间渗透压改变，AQP3、AQP4 mRNA表达水平降低，转运进入细胞内的水减少，进而诱导胃黏膜腺体萎缩。各给药组大鼠胃组织AQP1 mRNA表达水平下调，AQP3和AQP4 mRNA表达水平明显上调，可促进更多的细胞间隙水转运至黏膜细胞，抑制胃黏膜腺体萎缩。

综上所述，养阴活胃合剂改善胃分泌功能的机制与其调节AQP的基因表达水平，影响胃黏膜细胞的水液代谢有关。