电针太冲、足三里对自发性高血压大鼠心肌纤维化的改善作用

蔚鹏程，薛艳君，吴娇娟，吕桃桃，张旭东，杨可桢，刘清国

(北京中医药大学针灸推拿学院，北京 100029)

最新流行病学调查显示，2012-2015年中国18岁及以上居民高血压病的粗患病率为27.9%，且仍呈上升的趋势。高血压病作为一种慢性疾病，长期进展会引起心肌重构，心肌纤维化是心肌重构的重要病理过程，纤维化带来的心脏功能下降长期发展会导致心力衰竭，严重可危及生命。目前，国外进行了多项临床试验，但仍未取得满意疗效。同时，已有多项研究证实中医药在心肌纤维化的治疗方面具有良好疗效，且无明显不良反应。目前，关于针刺治疗高血压病引起的心肌纤维化的相关研究较少。本研究通过观察电针干预自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)“太冲”“足三里”穴对大鼠心肌重构的影响，初步探讨电针改善高血压心脏损伤的可能机制。

1 材料

1.1 实验动物 选用36只SHR，12只Wistar大鼠，均为SPF级，7周龄，雄性，体质量(200±15)g，购于北京维通利华公司实验动物中心[动物生产许可证号：SCXK(京)2016—0006]。购进后适应性喂养1周。

1.2 实验试剂与仪器 恒温式无创血压仪(BP-6)：成都泰盟科技有限公司；中研太和牌无菌针灸针(0.25 mm×13 mm)：无锡佳健医疗器械有限公司；韩氏穴位针灸刺激仪(HANS-200E)：南京济生医疗科技有限公司；酶联免疫试剂盒(JL11637)：上海江莱生物科技有限公司；Masson试剂盒(MD7056)：北京百奥思科生物医学技术有限公司；氯沙坦钾片(J20180054，每片100 mg)：默沙东制药有限公司；Trizol(10296028)：美国Invitrogen；荧光定量PCR仪(Step One Software)：美国Applied Biosystems。

2 方法

2.1 动物分组 将SHR按随机数字表法随机分为模型组、电针组、药物组，每组12只；另设12只Wistar大鼠作为空白组。

2.2 干预措施 ①空白组与模型组：只进行抓取及固定刺激，让大鼠钻入自制鼠套中，并将鼠套固定于实验桌上，固定时间20 min，其余各组采用相同固定方式。②灌胃操作：将氯沙坦钾片用研钵研磨成细粉后，根据大鼠体质量，按照30 mg/kg称出对应的药粉用量，将药粉用纯水溶解成3 mg/mL的悬浊液，灌胃前充分摇匀，按照大鼠体质量以10 mL/kg药液量进行灌胃，并同样进行抓取固定刺激；空白组、模型组、电针组用等量纯水进行灌胃。各组均每周灌胃6 d，休息1 d。③针刺操作：分别于双侧太冲穴直刺1～2 mm(皮下层)、足三里穴直刺4～5 mm(肌肉层)，进针后同侧太冲与足三里穴上的毫针分别连接电针仪的正极与负极，刺激强度为0.3 mA，频率2 Hz，刺激20 min。实验周期21 d，每隔6 d休息1 d。

2.3 血压测量 于治疗的前1天及治疗第7、14、21天上午的固定时间段在大鼠清醒状态下使用无创血压仪测量其尾动脉收缩压，每只大鼠连续测量3次，取平均值以减少误差。

2.4 取材与指标检测 取材前禁食12 h，不禁水，大鼠腹腔注射5%水合氯醛溶液(麻醉剂量：6 mL/kg)。麻醉后开胸，取心脏，每组随机取3只大鼠心脏，置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋后切成5 μm厚度切片。Masson染色，按照试剂盒操作说明书处理，封片后通过显微镜观察左心室心肌病理改变。各组其余大鼠取心尖组织留用，经液氮冻存后，存放在-80 ℃冷冻室内，酶联免疫吸附法检测各组大鼠左心室中血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)的含量，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。qPCR检测大鼠左心室细胞外信号调节激酶1/2(extracellular-regulated kinase 1/2，ERK1/2)、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ mRNA含量。将收集的心肌组织加入Trizol溶液研磨，按Trizol试剂的操作说明书进行分离提取心肌组织总RNA，合成第一链cDNA。合成引物序列如下：

ERK1/2 正向:5′-ACCTGAAGCCCTCCAAT-3′；反向:5′-CTCGGTAAGAAAGCCAGTGTGGTCG-3′。胶原蛋白Ⅰ正向：5′-CCAGCGGTGGTTATGACTT-3′；反向：5′-GGCTGCGGATGTTCTCAAT-3′。胶原蛋白Ⅲ正向：5′-CCACCCTGAACTCAAGAGC-3′；反向：5′-CATCTGTCCACCAGTGCTT-3′。GAPDH正向：5′-AAGATGGTGAAGGTCGGTGT-3′；反向：5′-GCTTCCCATTCTCAGCCTTG-3′。反应条件为预变性：95 ℃ 5 min；PCR反应：95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，循环40次；融解曲线分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，反应结束后确认扩增曲线和融解曲线。

3 结果

3.1 不同时点各组大鼠收缩压比较 与空白组比较，各时点模型组大鼠尾动脉收缩压均显著升高(

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05)；与模型组比较，治疗第14天、第21天电针组、药物组收缩压显著降低(

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05)。见表1。

表1 不同时点各组大鼠收缩压比较

3.2 各组大鼠心肌组织变化比较 经Masson染色后，正常心肌组织为红色，胶原纤维为蓝色。电针组及空白组心肌组织形态正常，空白组在血管周围可见少量胶原纤维均匀分布；模型组胶原纤维含量明显增加，并深入心肌组织间隙，呈明显不均匀分布，形态杂乱；药物组心肌组织间有少量胶原纤维，但含量明显减少。见图1。

3.3 各组大鼠左心室Ang Ⅱ含量，ERK1/2、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ mRNA表达水平比较 与空白组比较，模型组大鼠左心室AngⅡ含量，ERK1/2、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ mRNA表达水平均显著升高(

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05)；与模型组比较，电针组、药物组大鼠左心室AngⅡ含量，ERK1/2、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ mRNA表达水平均显著降低(

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05)。见表2。

表2 各组大鼠左心室AngⅡ含量，ERK1/2、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ mRNA表达水平比较

注：A.电针组；B.空白组；C.模型组；D.药物组

4 讨论

高血压病可归属于中医学“眩晕”“头风”等病范畴。《素问·标本病传论》：“肝病，头目眩，胁支满。”《灵枢·经脉》：肝经“上出额，与督脉会于巅。”《医宗金鉴》：“肝性急善怒……发于上，则头眩耳鸣，而或为目赤。”可见，眩晕与肝脏密切相关。研究数据分析指出，各种症状共同提示原发性高血压的基本病机与肝密切相关。《灵枢·九针十二原》：“五脏有疾，当取之十二原”，太冲为肝经原穴，能够疏肝理气、平肝潜阳，为治疗高血压病要穴之一。足三里为阳明经合穴、下合穴，《灵枢·邪气藏府病形》：“合治内府”，足三里善补益一身之气，通调气血，血充则肝血旺，血旺则柔肝而平和阴阳，同时补脾胃并调肝，扶土抑木。《难经·六十八难》：“合主逆气而泄”，足三里有降逆气，调理气机的作用。临床研究显示，针刺足三里穴可益气扶本，促进气血运转，能够有效治疗顽固性高血压。

高血压病作为一种慢性疾病，其长期存在会加重心脏负荷，导致心肌的结构功能发生改变，主要表现为心肌肥大和心肌纤维化的形成。纤维化的主要特征是心肌间质成纤维细胞增殖以及其分泌的细胞外基质蛋白沉积。

AngⅡ作为肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)的主要效应成分，通过与靶细胞膜上的血管紧张素Ⅰ型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R)结合来发挥作用。除收缩血管等升压效应外，AngⅡ与AT1R结合后还会介导细胞增殖和纤维沉积等进程。随着研究的深入，除了在循环系统中的RAS外，在不同的组织中也发现了RAS成分的存在，因此有了局部或组织RAS的概念。机体体液量的快速调节与循环系统中的RAS关系更加密切，而在高血压引起的器官重构方面，局部或组织内的RAS则发挥着主要作用。本研究发现，高血压大鼠左心室组织AngⅡ表达水平上调，这提示高血压大鼠左心室可能存在局部RAS激活。

在RAS介导的心脏病理改变过程中，ERKs是其中的重要环节。作为丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)家族成员之一，ERK1/2转导途径与细胞肥大、增殖等过程密切相关，是多种促增殖信号转导途径的核心成分。AngⅡ与AT1R结合后能迅速激活ERK1/2信号转导途径，促进心肌成纤维细胞转化、增殖，进而导致胶原的合成和分泌增加。辛博等通过皮下植入胶囊渗透压泵的方法，连续4周持续滴注AngⅡ，病理结果显示，小鼠心肌间质胶原含量显著增多，出现心肌间质纤维化现象，胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ等与纤维化相关的基因表达水平均上调，说明AngⅡ诱导了小鼠心肌纤维化的发生。AngⅡ可激活心肌中ERK1/2通路，磷酸化的ERK1/2介导了心肌细胞间基质的沉积和心肌纤维化的发展。周易等通过收集扩张型心肌病心脏移植术患者的心肌组织，检测扩张型心肌病患者心肌组织中MAPKs信号通路的磷酸化水平，结果发现MAPKs磷酸化激活与扩张型心肌病患者心肌纤维化的发生发展密切相关，抑制MAPKs信号通路激活可能会有效改善扩张型心肌病患者的心肌纤维化。吴奇芳等研究表明，敲除TRPC6基因可下调ERK信号通路的活性，从而减轻异丙肾上腺素诱导的心肌纤维化。

正常生理状态下，心肌中Ⅰ型与Ⅲ型胶原蛋白所占比例相对恒定，以维持心脏正常功能和结构，而当心肌纤维化发生时，心肌组织中胶原蛋白Ⅰ与胶原蛋白Ⅲ合成增加，比例明显升高。心肌纤维化的金标准是对组织内的胶原蛋白进行直观的检测，并且组织学研究结果指出，高血压所导致的纤维化具有由血管周围开始发生，并逐步向肌间隙蔓延的特征。本研究显示，电针组及空白组心肌组织形态正常，空白组在血管周围可见少量胶原纤维均匀分布；模型组在血管周围胶原纤维含量明显增加，并深入心肌组织间隙，呈明显不均匀分布，形态杂乱；药物组也可见组织间少量胶原纤维，但含量明显减少。

本实验通过对SHR左心室AngⅡ含量，ERK1/2、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ mRNA进行检测发现，相比于空白组，模型组大鼠左心室AngⅡ含量，ERK1/2、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ mRNA表达水平明显升高(

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<0.05)；相比于模型组，电针组大鼠左心室AngⅡ含量，ERK1/2、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ mRNA表达水平明显降低(

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05)，说明模型组存在AngⅡ-AT1R-ERK1/2-胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ通路的激活，而电针能够对AngⅡ、ERK1/2信号通路产生影响，进而下调大鼠心肌胶原蛋白的表达，从而起到抑制高血压心肌纤维化的作用，这可能是针刺能够有效减缓高血压心脏损伤的机制之一。