针刺对便秘型肠易激综合征大鼠肠运动及胃肠激素含量的影响

高 纺，周美启

(1.安徽中医药大学中医学院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中医药科学院亳州中医药研究所，安徽 亳州 236800)

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)以腹部不适、腹痛、腹胀为主要表现，并伴有排便习惯和(或)粪便性状改变，且无器质性病变，以便秘型和腹泻型最为常见。近年来，对于针刺治疗便秘型IBS(constipation-predominant irritable bowel syndrome，IBS-C)的机制研究较多，其中脑-肠轴成为近年来研究的热点之一。然而介导脑与肠之间的联系中，神经内分泌递质起到重要作用。其中5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)、P物质(substance P，SP)等神经递质调控胃肠功能有着关键性作用。为了进一步研究针刺腧穴是否通过对5-HT、VIP、SP等神经递质的影响而发挥调控胃肠运动的可能机制，本研究在以往研究的基础上，建立贴近临床的IBS-C大鼠模型，以小肠推进率为观察指标，以5-HT、VIP、SP为生化指标，探讨针刺治疗IBS-C的机制。

1 材料

1.1 实验动物 选取健康、清洁级SD大鼠60只，雌雄不拘，体质量(200±20)g，由安徽中医药大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(皖)2017—001。随机选取10只作为正常对照组，其余50只采用寒冷—束缚—饥饱失常综合法复制IBS-C模型，进行模型评价后随机选取30只，采用随机数字表法分为模型组、四单穴组方组、非经非穴组，每组10只。环境温度约20 ℃，湿度约55%，常规饲料喂养。

1.2 药品与试剂 活性炭粉末：无锡市亚泰联合化工有限公司；羧甲基纤维素钠：广东味多美食品配料有限公司；5-HT、VIP、SP抗体：北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 仪器与设备 JD-801形态学图像分析系统：江苏省捷达科技发展有限公司；BX51荧光显微镜：日本奥林巴斯；TB-718C生物组织自动包埋机：湖北泰维科技实业有限公司；Leica2135组织切片机：德国莱卡。

2 方法

2.1 动物模型复制与评价

2.1.1 活性炭粉悬浊液的制备 取5 g羧甲基纤维素钠，溶于125 mL蒸馏水中，分别加入8 g奶粉、4 g糖、4 g淀粉和1.5 g活性炭末，搅拌均匀，配制成150 mL的黑色半固体糊状物。冰箱冷藏，用时水浴加温即可。

2.1.2 IBS-C大鼠模型复制 应用寒冷、饥饱、束缚等多种刺激方法综合运用，保持应激环境。①束缚敷冰法：首先将大鼠四肢固定，用自制的大鼠腹带将冰袋和大鼠腹部绑在一起，时刻观察大鼠生存状态，至冰袋开始融化时结束。②冰水灌胃法：取出冰水混合物，按每只10 mL/kg，口服。③冰水游泳法：将大鼠放进30 cm高度容器中，注入0 ℃冰水混合物，游泳30 min，观察大鼠实时动态，以防淹死。④饥饱失常法：饥饱隔日交替进行，且正常饮水。除每日饥饱交替外，其余方法均依次使用。即第1天敷冰袋，给食；第2天口服冰水混合物，禁食；第3天在0 ℃冰水里游泳，给食。3 d为1轮，刺激6轮共计18 d。模型复制期间，每天密切观察并测量大鼠的大便干湿度、体质量变化并记录。

2.1.3 模型评价 按文献[4]方法，末次刺激结束后对模型进行评价。①模型复制前后体质量比较，差异有统计学意义(

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<0.05)；②模型复制后首次排便时间明显延长(

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05)；③模型复制前后大便干湿度比较，差异有统计学意义(

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05)。将满足①②③项的大鼠评定为模型复制成功并纳入实验，将其随机分为模型组、四单穴组方组、非经非穴组，每组10只。

2.2 针刺方法 腧穴定位参照全国普通高等教育“十五”国家规划教材《实验针灸学》中的“常用实验动物针灸穴位”取穴标准。四单穴组方由“天枢”“大肠俞”“曲池”“上巨虚”组成。天枢：脐中旁开约5 mm处，左右侧各一，左右交替针刺；大肠俞：第4腰椎下旁开7 mm处，左右侧各一，左右交替针刺；上巨虚：小腿背外侧上2/5折点处，约当后三里穴下1.5 mm，左右交替针刺；曲池：肘关节外侧前部凹陷中，左右交替针刺。非经非穴组即在鼠尾部组织处选取。针刺天枢、大肠俞和曲池、上巨虚时，取同侧腧穴，分别刺入正负两极的2根直径为0.30 mm、长度为25 mm的毫针，并连接至电针治疗仪。两组刺激参数一致：电流均为1.1 mA，频率均为2 Hz。连续电针15 min。约24 h电针1次，共7次。正常对照组、模型组均不予电针。

2.3 观察指标与检测

2.3.1 小肠推进率 采用活性炭混悬液灌胃法测定小肠推进率。末次针刺结束后，立即给予每只大鼠灌服活性炭混悬液2 mL，20 min后，采用10%水合氯醛将各组大鼠麻醉，开腹，取出小肠，剥离后直铺于实验台上，将幽门至含有黑色碳粉排泄物前沿的肠段自然伸直，用直尺测量其长度及幽门至回盲部自然长度。小肠推进率=幽门至黑色碳粉排泄物前沿的长度/幽门至回盲部长度×100%。

2.3.2 血清5-HT、VIP、SP水平测定 采用2%戊巴比妥钠腹腔注射，麻醉后开腹，从腹主动脉取血，3 500 r/min离心5 min后，取出上清液，于-80 ℃冰箱保存，采用ELISA法检测5-HT、VIP、SP水平。

2.3.3 结肠组织中5-HT、VIP、SP表达水平的测定 测定肠道长度后，立即剪取回盲部近端结肠2 cm，用生理盐水冲洗干净，置于10%甲醛固定液固定24 h后，进行石蜡切片、脱蜡及复水、热修复浸泡等处理，具体按照免疫组织化学法的常规操作步骤进行。采用图像分析系统分析阳性细胞表达的平均光密度(optical density，OD)值。

2.3.4 图像分析 每张切片均在CaseViewer系统300倍焦距下随机抓拍5个代表性高清视野，用Image J软件分别分析OD值。

3 结果

3.1 结肠的组织形态学观察 显微镜下每张切片的结肠组织结构清晰，未见红细胞及炎症细胞浸润等异常改变。

3.2 各组大鼠小肠推进率比较 与正常对照组比较，模型组大鼠小肠推进率显著降低(

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05)；与模型组比较，四单穴组方组大鼠小肠推进率显著升高(

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05)。见表1。

表1 各组大鼠小肠推进率比较

3.3 各组大鼠血清5-HT、VIP、SP水平比较 与正常对照组比较，模型组大鼠血清5-HT、VIP水平显著升高(

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05)，SP含量显著降低(

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05)；与模型组及非经非穴组比较，四单穴组方组大鼠血清5-HT、VIP水平均显著降低(

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05)，SP水平均显著升高(

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05)。见表2。

表2 各组大鼠血清5-HT、VIP、SP水平比较

3.4 各组大鼠结肠组织中5-HT、VIP、SP阳性细胞表达水平比较 模型组与非经非穴组5-HT、VIP、SP阳性细胞呈黄棕色或深褐色梭形或颗粒状，主要分布于黏膜层、肌层，均与四单穴组方组中阳性细胞表达水平有明显差别。见图1。与正常对照组比较，模型组大鼠结肠中5-HT、VIP表达水平显著升高(

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05)，SP表达水平显著降低(

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05)；与模型组及非经非穴组比较，四单穴组方组大鼠结肠中5-HT、VIP表达水平显著降低(

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05)，SP表达水平显著升高(

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05)。见表3。

图1 大鼠结肠组织中5-HT、VIP、SP阳性细胞表达水平(免疫组织化学法，10×30倍)

表3 各组大鼠结肠组织中5-HT、VIP、SP阳性细胞表达水平比较

4 讨论

中医学并未有IBS的详细记载，依据其主要临床表现可将其归属于“泄泻”“腹痛”“便秘”“郁证”等范畴。近年来，IBS患者越来越多并趋向年轻化，临床上多采用药物对症治疗，但收效甚微。IBS已成为国内外亟待解决的难题之一。针灸作为中医学的独特疗法，近年来在预防与治疗IBS方面发挥了重要作用。越来越多的临床及实验研究证实，针灸对胃肠道调节具有双向性，使失常的肠道运动功能趋向正常化，能够调节脑肠肽的表达水平、胃肠动力、内脏高敏感性及精神异常等。针灸因其疗效确切，无明显不良反应，便于操作等优点，而被广泛运用于治疗消化道疾病，越来越被全世界人们所接受，但其治疗IBS的机制尚未明了。

5-HT是一种单胺类神经递质，大多分布于胃肠道内和中枢神经内，主要由肠嗜铬细胞合成分泌，通常与三磷酸腺苷等物质一起储存于细胞颗粒内。在受到刺激时，5-HT从颗粒内释放，通过与其受体结合直接作用于肠道平滑肌细胞，影响肠道动力与肠道敏感性。如通过下调肠道组织中5-HT的阳性表达水平调节肠道动力及肠道敏感性，发挥对IBS-C治疗作用。研究发现，5-HT在脑-肠联系中，一方面作用于内脏传入神经及肠神经系统，促使多种脑肠肽的分泌与激活，参与脑与肠之间信号的传递；另一方面，5-HT与其受体结合，致使肠道运动、分泌及敏感性的改变，产生一系列的临床症状。另外，VIP不仅分布于黏膜固有层和肌层神经纤维的胃肠道中，而且在中枢神经和外周神经末稍周围也有大量分布。因此，VIP对肠道细胞有直接的作用，VIP既是一种胃肠道激素又是一种非肾上腺能非胆碱能神经抑制系统的神经递质，通过两条途径即一氧化氮相关性途径和cAMP依赖的蛋白激酶途径作用于平滑肌的运动，具有减慢胃排空，调节胃肠道规律性蠕动和参与结肠的节段非推进性运动等作用。VIP大多分布于胃肠道内和中枢性神经内，加快胃肠蠕动，增强收缩消化道平滑肌，促进结肠的节段推进运动。综上，5-HT在机体受到刺激时会大量分泌，但必须与其受体结合才能发挥调节胃肠道功能作用。VIP作为一种抑制性神经递质，具有减少胃肠分泌，抑制胃肠蠕动的作用。SP作为一种兴奋性脑肠肽神经递质，与VIP胃肠功能作用相对应。因此，在生理状态下，以上脑肠肽在维持正常胃肠道功能方面起到至关重要的作用。故本研究以5-HT、VIP、SP作为研究的切入点，初步分析针刺对IBS-C大鼠可能的作用机制。

天枢穴是大肠之募穴，是脏腑之气汇聚之处，针刺天枢穴能够调节胃肠功能。大肠俞为大肠经的背部俞穴，是大肠经气输注的部位，是胃肠疾病的反应点，也是治疗便秘的有效输穴。曲池穴是手阳明大肠经之合穴，上巨虚穴为大肠之下合穴，“合治内腑”，主治胃肠疾病。实验研究表明，电针四单穴能够降低下丘脑及结肠组织5-HT1AR和c-fos蛋白表达，改善IBS的临床症状，艾灸天枢、大肠俞能抑制VIP、SP表达或上调水通道蛋白8的表达水平，从而改善肠道疾病。由此可见，针刺四单穴对胃肠功能的调节具有重要作用。以往研究结果证实，针刺四单穴对IBS-C大鼠症状的改善最显著，故本研究选用四单穴为治疗腧穴。

本实验结果显示，模型组大鼠小肠推进率明显降低，结肠、血清中5-HT、VIP水平明显升高，SP水平明显降低，说明肠道蠕动减慢，模型复制成功。与模型组比较，四单穴组方组小肠推进率明显升高，结肠、血清中5-HT、VIP表达水平明显降低，SP水平明显升高，差异均有统计学意义(

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05)。结果说明针刺四单穴对IBS-C具有明显的改善作用，其作用机制可能与降低结肠、血清中5-HT、VIP表达水平，升高SP的表达水平有关。