银杏内酯B对高眼压青光眼大鼠视网膜缺血损伤的研究*

蒲卫星，赵军波，尹晓玲

邯郸市中心医院，河北 邯郸 056000

青光眼是由进行性视神经退行性病变引起的以视功能与视神经损害为主要特征的盲性眼病。致病因素较多，主要包括病理性眼压上升、视神经血流灌注减少等[1]。该病起病较为隐匿，许多患者因为失去最佳救治时间而失明[2]。据估计，2020年世界青光眼患者可达7 960万[3]。该病发病率、致残率均较高，受到人们的广泛关注。研究发现，青光眼功能损伤的病理机制可能与视网膜神经节细胞凋亡有关[4]。银杏叶提取物银杏内酯B能够保护视网膜神经节细胞，并抑制细胞凋亡[5]。本研究通过烙闭上巩膜静脉法制备高眼压青光眼大鼠模型，观察银杏内酯B对大鼠眼压及视网膜p-Akt、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、Caspase-9表达的影响，探究其保护高眼压青光眼的作用。

1 材料

1.1 动物40只SPF级健康SD大鼠，体质量180～220 g，雌雄各半，购自成都达硕实验动物有限公司，合格证号：SYXK(川)2014-189。饲养环境于温度20～25 ℃，相对湿度55%～75%，自然光照。实验过程严格遵循《关于善待实验动物的指导性意见》，伦理号：nssb6000842。

1.2 药物与试剂银杏内酯B(成都德思特生物技术有限公司，批号：019221)；Caspase-9抗体(深圳市豪地华拓生物科技有限公司，货号：PL-0301735)；NF-κB抗体(武汉Proteintech公司，货号：14220-1-AP)；p-Akt抗体(厦门慧嘉生物科技有限公司，货号：F48643)；盐酸丙美卡因滴眼液(苏州工业园区天龙制药有限公司，批号：L1901221)；金霉素眼膏(北京双吉制药有限公司；批号：20191011)；氯霉素滴眼液(四川美大康华康药业有限公司；批号：7325144)；戊巴比妥钠(上海思域化工科技有限公司，批号：201908072)。

1.3 仪器Mias-2000型图形图像分析仪(美国Media Cybernetics公司)；CX23型显微镜(日本Olympus公司)；BX51型眼科显微镜(日本Olympus公司)；Mikro 200R型冷冻离心机(德国Hettich公司)；RM2235型石蜡切片机(德国Leica公司)。

2 方法

2.1 动物分组与模型建立大鼠纳入标准：①无歪颈；②双眼瞳孔直接(间接)对光反射正常；③无外眼疾病。适应性饲养3 d后测量大鼠眼压，将眼压 9～18 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)范围内的大鼠进行随机分组，即对照组、模型组与银杏内酯B组。本研究选择的40只大鼠眼压测量结果均合格。将大鼠随机分为对照组(10只)、模型组(15只)、银杏内酯B组(15只)，除对照组外，其余大鼠在眼科显微镜下通过烙闭上巩膜静脉法制备高眼压青光眼模型。将大鼠称重后，腹腔注射30 g·L-1戊巴比妥钠进行麻醉，并给予手术眼(右眼)5 g·L-1盐酸丙美卡因滴眼液进行角结膜表面麻醉，撑开眼睑，从距离角巩膜缘1～2 mm处将球结膜剪开使筋膜分离充分暴露角巩膜缘。用眼科手术止血器对大鼠上直肌旁两条巩膜上静脉及颞侧一条巩膜上静脉进行烙闭，整复球结膜[6]。左眼作为对照眼不进行烙闭，右眼涂金霉素眼膏。对照组大鼠不采取任何措施，术后模型组与银杏内酯B组大鼠采用2.5 g·L-1氯霉素滴眼液滴眼，每天2次。7 d后检测模型组与银杏内酯B组大鼠眼压水平，手术眼与正常眼眼压差>10 mm Hg为模型复制成功[7]，剔除造模失败大鼠，各组均保留10只大鼠进行后续实验研究。银杏内酯B组按40 mg·kg-1的剂量腹腔注射银杏内酯B，对照组与模型组均注射等体积生理盐水，每天1次，连续给药8周。

2.2 检测指标

2.2.1 检测大鼠各阶段眼压水平采用眼压计检测各组大鼠造模前、造模后与给药后的眼压水平。

2.2.2 观察大鼠眼球组织形态变化给药8周后，将大鼠进行麻醉，沿眼角膜缘将球结膜剪开分离大鼠眼球。用40 ng·L-1多聚甲醛固定眼球，脱水、包埋后进行切片，用蒸馏水冲洗后采用苏木素染色，5～10 min后冲洗干净，并用 10 g·L-1盐酸乙醇分化 0.5 min；在蒸馏水中浸泡15 min并用伊红复染；2～5 min后用乙醇(95%乙醇Ⅰ-95%乙醇Ⅱ-无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ)进行脱水，在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各浸泡1 min，透化，之后采用中性树脂进行封片；通过显微镜观察大鼠眼球组织形态变化。

2.2.3 检测大鼠视网膜神经节细胞数量及视网膜厚度采用显微镜观察大鼠视网膜组织病理变化，20倍物镜下记录各组大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，RGC)数量，每张切片分别取10个视野，10个视野的观察均值即为该张切片RGC数量的测量值。从视盘出开始，分别向两侧各取5个视野，观察各组视野测量大鼠视网膜厚度，采用图形图像分析仪测量大鼠视网膜厚度，每张切片10个视野的测量均值即为该张切片视网膜厚度的测量值。

2.2.4 免疫组化法检测大鼠视网膜p-Akt、Caspase-9、NF-κB的表达视网膜石蜡切片常规脱蜡后用3%双氧水常温孵育10 min，用蒸馏水冲洗后在PBS内浸泡5 min；往视网膜组织切片滴加血清进行封闭，并在室温下孵育10 min；去除血清后分别滴加p-Akt、Caspase-9、NF-κB 抗体(稀释比例均为1100)，4 ℃孵育过夜；用0.01 moL·L-1PBS洗涤3次；滴加生物素标记二抗，37 ℃孵育30 min，用PBS洗涤3次；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液37 ℃孵育30 min，用PBS洗涤3次，DAB显色，苏木素复染，冲洗4 min并经梯度酒精脱水，在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各浸泡1 min，中性树脂封片，镜检；p-Akt、Caspase-9、NF-κB 阳性染色细胞呈棕黄色，每张切片各取5个视野，采用图形图像分析仪检测其表达水平。

3 结果

3.1 大鼠各时期眼压的检测造模前，3组大鼠眼压水平比较均无明显差异(P>0.05)；造模后与造模后8周，模型组与银杏内酯B组大鼠眼压均明显高于同期对照组(P<0.05)；模型组大鼠造模后与造模后8周眼压水平比较无明显变化(P>0.05)；银杏内酯B组大鼠造模后8周眼压水平较造模后有所降低。见表1。

表1 各组大鼠各时期眼压水平比较

3.2 观察大鼠眼球组织形态变化对照组大鼠视神经纤维排列较为紧密，且未出现炎性细胞；模型组大鼠视神经纤维排列较为杂乱，纤维间质间出现空泡与水肿，神经元细胞大量死亡，细胞核聚集、胞膜破裂；银杏内酯B组大鼠神经纤维排列不整齐，纤维间质间也出现水肿与空泡，但较模型组有所改善。见图1。

注：A：对照组；B：模型组；C：银杏内酯B组图1 各组大鼠眼球组织形态变化(HE，×200)

3.3 大鼠视网膜神经节细胞数量及视网膜厚度的检测与对照组比较，模型组大鼠视网膜神经节细胞数量明显减少，视网膜厚度明显变薄(P<0.05)；与模型组比较，银杏内酯B组大鼠视网膜神经节细胞数量明显增多，视网膜厚度明显变厚(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠视网膜神经节细胞数量及视网膜厚度比较

3.4 大鼠视网膜p-Akt、Caspase-9、NF-κB表达的检测与对照组比较，模型组大鼠视网膜Caspase-9平均光密度明显增加(P<0.05)，p-Akt、NF-κB平均光密度明显减少(P<0.05)；与模型组比较，大鼠视网膜Caspase-9平均光密度明显减少(P<0.05)，p-Akt、NF-κB平均光密度明显增加(P<0.05)。见表3、图2。

表3 大鼠视网膜p-Akt、Caspase-9、NF-κB表达的检测

注：A：对照组；B：模型组；C：银杏内酯B组图2 各组大鼠视网膜免疫组化检验结果(×200)

4 讨论

当前治疗青光眼主要是降低患者眼压[8]。但仍有部分患者会出现眼压降至正常水平，但视野缺损与RGC凋亡仍呈进行性发展的情况，可见单纯降低眼压并不能有效避免青光眼视神经进行性损伤[9]。保留患者视功能的关键仍在于延长RGC的存活时间，并增加RGC的数量[10]。

中医学将青光眼归为“青盲”“五风内障”的范畴，认为其病机在于神水瘀滞、脉络不利，久病则脉络瘀滞、肝肾虚损，终成“青盲”[11]。《本草纲目》中记载银杏叶性平，味甘、苦、涩，具有敛肺、平喘、活血化瘀、止痛的功效。研究表明，银杏叶中包含20余种银杏内酯与黄酮类物质[12]，银杏内酯又可分为A、B、C、J、M与白果内酯等单体。研究报道，银杏叶提取物可用于神经元变性疾病的治疗[13]，同时具有抑制血小板活化因子、谷氨酸毒性及一氧化氮合酶，还能保护线粒体功能，起到抗缺血、抗氧化作用[14]。银杏叶提取物可通过抗氧化对视网膜神经细胞起到保护作用，还可改善视网膜的血供情况，从而抑制视网膜神经节细胞凋亡[15]。

银杏内酯B是从银杏叶中提取的有效成分，有保护肝脏、抗氧化、抗炎、调节眼部损伤、保护胃肠黏膜、降低心肌再灌注损伤等作用[16-17]。方敏等[18]研究指出，银杏内脂B微乳油剂能增加大鼠眼动脉24%血流量，对大鼠视网膜线粒体有保护作用，从而改善大鼠的视神经功能。本研究结果表明，高眼压青光眼大鼠RGC数量明显减少，说明高眼压青光眼大鼠视功能受到严重损伤，RGC大量凋亡，导致视功能损伤及视野缺损。经过银杏内酯B治疗后，大鼠RGC数量明显增多，提示银杏内脂B可以促进视网膜神经节细胞增殖分化，从而改善高眼压青光眼大鼠视功能。

研究证实，PI3K/Akt通路的激活能促进神经元存活，有效抑制RGC凋亡[19]，作用机制可能涉及对p-Akt、Caspase-9、NF-κB表达的调控。Akt是PI3K的下游靶标，主要负责生物信息的转导过程[20]。PI3K的第二信使与Akt及磷酸酰基醇依赖性蛋白激酶PH结构域相结合可以产生具有磷酸酶活性的p-Akt，并启动与细胞增殖分化凋亡等相关程序，作用于内质网、线粒体等细胞器，发挥抑制细胞凋亡的作用[21]。当细胞受到不良刺激时 NF-κB 会被快速活化并与细胞基因的增强子与启动子相结合，从而起到调节转录的作用，介导细胞生长的凋亡过程[22]，以NF-κB为中心的正向级放大信号转导通路有抗细胞凋亡的作用[23]。体外细胞实验证实，NF-κB可降低RGC的凋亡率，提示其可通过介导抗细胞凋亡途径起到保护青光眼患者的视力[24]。Caspase家族蛋白可通过级联反应促进细胞凋亡[25]，在眼部分布十分广泛，在RGC、感光细胞中均可检出[26]。其中Caspase-3与Caspase-9是参与细胞凋亡的重要激活剂，当细胞受到不良刺激时，细胞色素C从线粒体内进入胞浆并与Apaf-1相结合，通过激活Caspase-9进而激活Caspase-3，从而开启凋亡程序[27]。研究发现，高眼压青光眼大鼠眼压升至32 mm Hg时，Caspase-9表达到达峰值，RGC大量凋亡，从而得出RGC凋亡与Caspase-9表达上调相关[28]。本研究表明，银杏内酯B明显上调p-Akt、NF-κB表达，下调Caspase-9表达，进一步抑制对细胞凋亡的调节作用，从而有效保护高眼压青光眼大鼠。综上所述，银杏内酯B可促进视网膜神经节细胞增殖分化，改善高眼压青光眼大鼠视功能。