顶空固相微萃取-全二维气相色谱/飞行时间质谱测定三种芒果香气成分

黄 豆，曹烙文，岑延相，区梓峰，胡 韩，谭国斌，麦泽彬，黄正旭,，李 雪，吴曼曼,

（1.广州禾信仪器股份有限公司，广东广州 510530；2.暨南大学质谱仪器与大气环境研究所，广东广州 510632；3.广州智达实验室科技有限公司，广东广州 510632）

芒果（Mango）被称为“热带水果之王”，是杧果的通俗名，属漆树科（Anacardiaceae）杧果属（Mangifera）。芒果原产于印度的常绿大乔木，地理上主要分布在印度、孟加拉、中南半岛、马来西亚和中国（云南、广西、广东、福建、海南以及台湾）[1]。在我国，芒果的栽培面积是仅次于荔枝、龙眼及香蕉，排名第四的重要热带水果[2]。芒果富含大量维生素A，可抗癌、美化皮肤、防止高血压和动脉硬化、防止便秘、杀菌[3]等。

近年来，食品香味成分的研究引起了人们的广泛关注。果实的香气成分种类和含量是芒果的主要品质特性之一，是芒果风味与商品价值的一个重要参考指标[4−5]。刘传和等[6]利用顶空固相微萃取（Headspace Solid Phase Microextraction, HS-SPME）结合气相色谱-质谱法（Gas Chromatograph/Mass Spectrometer，GC-MS），对凯特芒、象牙芒、台农一号、四季芒四种芒果的果肉香气成分进行分析，四种芒果的果实共测到20种香气物质，萜烯是最主要的香气成分。张浩等[7]应用电子舌与SPME/GC-MS技术检测出金芒、青芒、红玉和贵妃四种芒果含有萜烯类、酯类与醛类等7大类挥发性有机物，并进行PCA（主成分分析法）分析确定了用于区分四种芒果的特征挥发性有机物。以上均采用HS-SPME结合GC-MS进行研究，受限于常规GC-MS的分离能力，检出的香气成分较少。全二维气相色谱（Comprehensive Two-dimensional Gas ChromatoGraph，GC×GC）技术是上世纪末逐渐发展起来的一种高效分离检测技术，与常规GC技术相比，具有高峰容量、高分辨率、高灵敏度、族分离等特点[8−9]，对复杂样品的全组分分离具有极强的优势。而飞行时间质谱仪（Time of Flight Mass Spectrometer, TOFMS）每秒能产生大于100张的全谱图，在高速采集的同时完整的保留质谱数据，是全二维色谱的最理想检测器[10−12]，因而全二维气相色谱结合具有高速采集功能的飞行时间质谱仪非常适用于石油[13−15]，风味[16−17]及环境[18−20]等复杂样品的分析。

目前国内外学者较多采用常规GC-MS对芒果中香气成分进行研究，尚未见到GC×GC-TOFMS用于研究芒果香气成分的相关报道。本文采用全自动HS-SPME结合GC×GC-TOFMS，对市面上常见芒果品种金煌芒、小台芒和青皮芒的香气成分进行了定性及对比分析，确定不同芒果品种在香气成分上的差异，旨在为芒果等果蔬类植物风味物质的精细分析开拓新方向。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金煌芒、小台芒和青皮芒 选取市面上大小均一、果实成熟完全、完整新鲜的芒果，购自永辉超市，数量若干，洗净去皮备用。

GGT 0620型全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪 广州禾信仪器股份有限公司；瑞士CTC全自动多功能在线前处理进样平台 广州智达实验室科技有限公司；769S型搅拌机 余姚市海蒂诗家用电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 将3种芒果果肉分别置于搅拌机捣碎，并称取5 g果肉于20 mL固相微萃取样品瓶中。

1.2.2 HS-SPME条件 萃取前老化温度为260 ℃，老化时间为15 min，振摇速度为350 r/min，萃取温度为60 ℃，萃取时间为60 min，进样深度为35 mm，解析温度为250 ℃。

1.2.3 GC×GC-TOFMS条件

1.2.3.1 气相色谱条件 进样口温度250 ℃；分流进样，分流比为5:1；一维色谱柱MEGA-WAX Plus（30 m×0.25 mm×0.25 μm），二维色谱柱DB-17MS（1.3 m×0.18 mm×0.18 μm）；载气为氦气，柱流量为1 mL/min；柱箱温度采用程序升温，起始温度为35 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升温到240 ℃，保持5 min，共49 min。

1.2.3.2 全二维气相调制器条件 采用固态热调制器，选择HV调制柱（1.2 m×0.25 mm），调制周期为5 s，其中解析时间为1 s；调制器进口和出口同步GC升温程序，进口始终比柱箱高30 ℃，出口始终比柱箱高120 ℃，冷阱保持−50 ℃。

1.2.3.3 飞行时间质谱条件 电子轰击离子源（Electron Impact Ion Source，EI），灯丝发射电流100 μA，电离能70 eV；离子源温度为230 ℃，传输线温度为280 ℃；检测器电压为−1900 V；采集质量范围为40～500 u，采集速度为100谱/s。

1.3 数据处理

采用全二维数据处理工作站软件Canvas载入数据，自动绘制全二维TIC轮廓图，并对图中信噪比大于3的峰自动识别，标识出的每一个峰点即代表一种化合物，每个化合物由一对保留时间确定，X轴方向为第一维保留时间（min），Y轴方向为第二维保留时间（s）。

在Canvas软件上通过对每个化合物的质谱图进行NIST17标准质谱数据库比对检索、结合保留指数[21−22]（Retention index，RI）等信息，对化合物进行定性分析；同时，软件采用峰面积归一化法自动生成各成分的相对含量。根据各化合物的定性定量信息，统计三种芒果鲜肉样品中的特征香气成分，并根据化合物官能团对香气成分进行分类并统计个数和相对含量。

2 结果与分析

2.1 HS-SPME条件优化

2.1.1 萃取头选择 以金煌芒为例，实验过程中对比100 μm PDMS（Polydimethylsiloxane）单相萃取头和50/30 μm DVB/CAR/PDMS（Divinylbenzene/Carboxen/Polydimethylsiloxane）三相萃取头，从表1中观察发现后者可萃取到更多的组分，其萃取的峰个数和总峰面积均多于100 μm PDMS萃取头。DVB/CAR/PDMS三相萃取头可以兼顾到极性与非极性各类组分，得到更为全面的分析结果，更适用于含有较多极性化合物组分的风味物质分析，本研究最终选用三相萃取头进行实验。

表1 不同萃取头的萃取效果Table 1 Extraction effect of different fiber

2.1.2 萃取温度优化 选择三相萃取头，实验过程中选择50、60和70 ℃的萃取温度，其余条件不变，依次测试金煌芒。萃取温度对SPME萃取效率的影响具有双面性，观察到较低的萃取温度有利于低沸点组分的萃取，较高的温度下有利于高沸点组分的萃取。根据表2的结果，本研究选择60 ℃的萃取温度，兼顾不同沸点的组分，有利于检测到更多的挥发性组分。

表2 不同萃取温度下的萃取效果Table 2 Extraction effect of different extraction temperature

2.1.3 萃取时间优化 选择三相萃取头，实验过程中分别使用50、60和70 min的萃取时间，其余条件不变，依次测试金煌芒。经过实验优化，从表3可知，萃取时间达到60 min后检测到的组分数量及总峰面积不再增加，确保分析物在样品与萃取头上达到分配平衡，同时尽量地缩短分析时间，故选取萃取时间为60 min。

表3 不同萃取时间下的萃取效果Table 3 Extraction effect of different extraction time

2.1.4 解吸参数优化 选择三相萃取头，实验过程中选择240、250和260 ℃的解吸温度，其余条件不变，依次测试金煌芒。较低的解吸温度不利于高沸点的组分进入色谱，太高的解吸温度会影响萃取头的使用寿命，同时也会带来更多的本底（如带来较多硅氧烷干扰）。通过表4可知，250 ℃的解吸温度时，总峰面积和有效化合物个数最多，故本研究选取250 ℃作为解吸温度。

表4 不同解吸温度下的萃取效果Table 4 Extraction effect of different desorption temperature

2.2 GC×GC-TOFMS条件优化

2.2.1 升温程序优化 常规的GC-MS在分析复杂的食品风味时，为了达到较好的色谱分离效果，需要采用低升温速率（1～3 ℃/min），或者采用梯度升温方式，最终导致整个分析周期很长（接近1.5 h）。本实验使用的GC×GC-TOFMS可以采用5 ℃/min快速升温让组分快速流出色谱柱，不到50 min即可完成整个采集过程。以某个局部分离效果为例（见图1），原本在保留时间28 min附近存在三个未分开的组分峰，但经过调制器捕集和二维柱再次分离后测得三个完全分离的十四醛（峰序号171）、5-丁基二氢-2（3H）-呋喃酮（峰序号170）和苯乙醇（峰序号172）。以上表明GC×GC-TOFMS测试芒果香气成分相比常规GC-MS具有良好的色谱分离效果。

图1 GC×GC和GC分离效果对比图Fig.1 Separation effect comparison of GC×GC and GC

2.2.2 柱系统优化 实验对比了反、正向全二维柱系统测试金煌芒的测试效果，其中反向柱系统一维柱采用强极性的MEGA-WAX Plus（30 m×0.25 mm×0.25 μm），二维柱采用中等极性的DB-17ms（1.3 m×0.18 mm×0.18 μm）；正向柱系统一维柱采用非极性的DB-5ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm），二维柱采用中等极性的DB-17ms（1.3 m×0.18 mm×0.18 μm）。图2为采用反向和正向柱系统测试金煌芒的二维色谱轮廓图，观察到采用正向柱系统时，极性较强的组分整体分离度差（如保留时间在5、15和27.5 min等区域），而且会出现二维峰拖尾（如多数极性较大的色谱峰存在明显的拖尾）以及峰迂回（极性较强的酸类迂回到下一周期）的情况，会对定性结果产生干扰；而在反向柱系统下，极性组分在一维柱拖尾现象显著减弱，同时极性相近组分分离度得到明显提升，故最终采用了反向柱系统。

图2 反向和正向柱系统测试金煌芒的二维色谱轮廓图Fig.2 Chromatogram of JinHuang mango tested by reverse and forward column systems

2.3 芒果香气成分质谱匹配结果

图3 分别为3-蒈烯、萜品油烯、邻伞花烃和α，α，4-三甲基苯甲醇4种含量较高的香气成分的实验质谱图与NIST 17谱库质谱图的匹配结果图，其中每张图的上部分为实验质谱图，下部分为NIST 17谱库的质谱图。实验结果显示4种化合物的正向匹配度（Forward Match，MF）和反向匹配度（Reverse Forward Match，RMF）均大于900，因此实验仪器定性的结果可靠。

图3 四种香气成分的质谱匹配图Fig.3 Mass spectrum matching map of four kinds of aroma components

2.4 三种芒果香气成分分析

2.4.1 芒果果实香气成分GC×GC-TOFMS轮廓图图4为金煌芒、小台芒和青皮芒的果实香气成分GC×GC-TOFMS轮廓图。使用Canvas工作站对三种芒果香气成分数据进行了自动峰积分，并使用NIST 17谱库结合保留指数对每个峰进行检索定性。金煌芒共检测到的挥发性组分有114种，其中香气成分96种，香气成分峰面积占比74.04%；小台芒检测到113种挥发性组分，香气成分有90种，峰面积占比90.75%；青皮芒检测到79种挥发性组分，香气成分68种，峰面积占比78.91%，可以看到不同品种芒果的香气组成化合物及其含量存在明显差异。前人研究芒果香气时，大多数采用常规GCMS分析芒果的香气成分，单个品种的芒果测到的香气组分一般不会超过50种[6−7]。而借助全二维强大的分离能力和高灵敏度，一方面能够测到共流出的组分，另一方面可以测到含量极低的组分，而这些痕量物质对芒果香气的贡献值却较大，需要着重研究。

图4 三种芒果的二维色谱轮廓图Fig.4 Chromatogram of three kinds of mangos

2.4.2 三种芒果果实香气成分对比分析 由表5可知，在170种香气成分中，三种芒果同时含有的香气成分有26种。三种芒果果实共有的26种香气成分中包含15种烯烃/环烷烃、4种醇类、1种酯类、1种酮类、1种酸类和2种芳香烃类。烯烃中单萜烯及倍半萜烯烃类化合物在三种芒果香气成分构成中都占有较大比率，特别是3-蒈烯（松木香气）及萜品油烯（又叫异松油烯，松木树脂味），两者总量在三种芒果香气成分中占比都超过20%，对形成芒果特有的香气都有重大的贡献，与前人研究的结果相似[6,23−24]。而2-蒈烯（甜香味）、柠檬烯（柠檬果香味）、α-水芹烯（清香味）和β-月桂烯（清淡的香脂香气）则进一步形成芒果特有的香气。三种芒果共有的香气成分有26种，比如萜品油烯、3-蒈烯、β-月桂烯、石竹烯、珂巴烯和γ-依兰油烯等萜烯类组分，组成芒果基本的香气，但共有成分在不同品种芒果中含量存在明显差异，比如金煌芒中3-蒈烯的含量明显更高，达到10.783%，小台芒中萜品油烯含量明显更高，为17.545%。

表5 三种芒果的香气成分及相对含量Table 5 Aroma components and relative contents of three kinds of mangos

将三种芒果中170种香气成分按照官能团分类，芒果香气成分主要由7类化合物构成。烯烃类（含环烷烃）56种、酯类46种、醇类25种、酮类18种、醛类15种、酸类6种、芳香烃4种。三种芒果香气成分中含量最高的均为烯烃类化合物，烯烃类是草香型香气物质；不同的是，金煌芒还含有较多的酯类、醛类及醇类等含氧化合物，酯类是果香型香气物质，对果实浓郁起主要贡献作用[25]；对小台芒及青皮芒而言，烯烃类化合物占据极大的比例，而含氧香气化合物明显较金煌芒偏低，另外两者都含有5%以上的芳烃香气（特异芳香味[26]）成分。

续表 5

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对于不同芒果品种中各自独有的成分，其中金煌芒有51种，占金煌芒香气成分含量的30.00%；小台芒有38种，占小台芒香气成分含量的22.35%；青皮芒有25种，占青皮芒香气成分含量的14.71%。金煌芒中丁酸乙酯、反,顺-2,6-壬二烯醛、十四醛、紫罗兰酮、呋喃酮及苯甲酸苄酯等低含量的组分，因其较低的气味阈值，呈现出对整体香气具有突出的贡献作用。可以看出，金煌芒独有的香味成分，比如酯类（果汁香韵及果香香韵）、醛类（清香韵）以及醇类（醇香韵）等含量更多，更加丰富；对应的青皮芒独有的香味成分则相对较少，这也是金煌芒香气浓郁，而青皮芒香气较寡淡的原因。

3 结论

采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS法在三种芒果品种共检测出170种香气成分，其中金煌芒、小台芒、青皮芒中分别测到96、90、68种香气成分，相对含量占各自总挥发性成分的74.04%、90.75%、78.91%。三种芒果共有的香气成分有26种，烯烃中单萜烯及倍半萜烯烃类化合物在三种芒果香气成分构成中都占有较大比率，特别是3-蒈烯（松木香气）及萜品油烯（松木树脂味），两者总量在三种芒果香气成分中占比都超过20%，对形成芒果特有的香气都有重大的贡献。而2-蒈烯（甜香味）、柠檬烯（柠檬果香味）、α-水芹烯（清香味）和β-月桂烯（清淡的香脂香气）则进一步形成芒果特有的香气，但共有成分的含量在不同品种芒果间存在差别。7类化合物中烯烃类化合物在三种芒果中含量占比最高，金煌芒与其他两种芒果相比，含有更多的酯类、醛类和醇类等香气成分，对应的青皮芒独有的香味成分则相对较少，这也是金煌芒香气浓郁，而青皮芒香气较寡淡的原因。结果表明，凭借全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪强大的分离及定性能力，可以获得比常规气相色谱-质谱联用仪更多的香气成分信息，对香精香料的精细化发展起到重要的促进作用。