原位电离质谱法表征及成像橙皮中多甲氧基黄酮类化合物

陈 雪，陈焕文， 梁汉东

（1.煤炭资源与安全开采国家重点实验室，北京 100083；2.东华理工大学，江西省质谱科学与仪器重点实验室，江西 南昌 330013；3.中国矿业大学（北京），地球科学与测绘工程学院，北京 100083）

0 引言

鲜橙因其爽口，富含维生素、微量元素等而受到人们的喜爱。人们在消耗大量鲜橙制品的同时，产生大量的橙皮废弃物。研究证明柑橘及甜橙果皮中含有丰富的多甲氧基黄酮，具有较好的抗炎活性和抗氧化活性[1-4]；最近研究显示，川陈皮素（nobiletin，NBT）具有较好抗癌细胞增殖活性[5]，刘伟等人[6]通过缩合反应等手段改变多甲氧基黄酮性质，以提高人体利用效率。

目前，测定果皮中黄酮类化合物主要是采用高效液相色谱（HPLC）或与质谱联用（HPLC-MS），方健等人[7]用HPLC 测定常山胡柚皮中黄酮类化合物指纹谱图。Wang Y 等人[8]利用HPLC-MS 测定了35 种柑橘类水果中的39 种黄酮类化合物。但是，这些常用方法样品处理过程无法了解目标黄酮在样品中的分布。近年来，原位质谱分析技术与方法发展迅速，其优点是无需复杂样品前处理，而方便快捷，并可成像[9]。

采用内部萃取电喷雾电离（iEESI）[10-12]和表面解吸电喷雾电离（DESI）[13-14]这2 种原位电离方式的质谱法直接分析表征橙皮中游离的黄酮类目标物，旨在检验橙皮中黄酮类化合物的种类及分布，并为我国大量橙皮废弃物[15-18]的高效提取利用提供参考。

1 试验部分

1.1 主要试剂与仪器

甲醇（质谱级）、甲酸（质谱级）、去离子水（质谱级），美国Fisher 公司提供；iEESI 离子源[11]，江西省质谱实验室自制。

LTQ 离子阱质谱仪，美国赛默飞公司产品；Synapt-G2-Si 高分辨飞行时间质谱仪（Q-Tof MS），美国沃特世公司产品，并配有DESI 离子源[12]及HDImage 数据处理成像软件；微量进样针，英国哈密尔顿公司产品。

1.2 样品及前处理

在当地超市购买同品种南非产鲜橙，取皮清洁后晾干，样品放入1%甲酸水溶液中浸泡4～6 h，取出后放入恒温冰箱中作iEESI 质谱分析（iEESI MS）试验备用，试验时将橙皮油胞层与白皮层切割为厚1 mm，长3 mm，宽2 mm 的等腰三角形薄片；样品在1%的甲酸水溶液中浸泡2 h，取出后放入-18 ℃冰箱中作DESI 高分辨质谱成像（DESI HRMSI）试验备用，试验时将橙皮沿横截面切割为0.5 mm 的薄片。

1.3 试验条件

1.3.1 iEESI MS 试验条件

试验装置图见图1。

图1 试验装置图

iEESI 源距质谱口2 mm，待离子源温度上升至150 ℃，用镊子将毛细管插入处理好的样品内部，毛细血管内部甲醇流速2 μL/min，在正离子模式下进行试验，电压为4 kV（已验证），质谱扫描范围m/z 50～600。具体试验装置如图1（a）所示。

1.3.2 DESI MSI 试验条件

将处理好的DESI MSI 样品用双面胶固定在载玻片上（双面胶范围尽量与样品大小相同），毛细管内部甲醇流速4 μL/min，待离子源温度升至150 ℃，正离子模式下电压4 kV（已验证）进行进样，质谱扫描范围质荷比为100～1 200。

2 结果与分析

2.1 iEESI MS

橙皮不同位点一级全扫描质谱图对比见图2。

图2 橙皮不同位点一级全扫描质谱图对比

橙皮油胞层和白皮层分别取样，对样品进行内部萃取电喷雾电离，得到质量范围在质荷比50～600的全扫谱图，扫描2 min 后，待信号稳定以后，记录信号强度较高的峰，以纯甲醇溶液为空白。一级谱图扣除空白后，白皮层与油胞层对比图（见图2），在通过多级串联质谱对照谱库进行定性。在油胞层取样点含有质荷比168，343，373，403 等特征峰；白皮层取样点含有质荷比156，167 等的特征峰。通过串联质谱及相关文献，将质荷比343，373，403 定性为四甲氧基黄酮（tetramethylfla-vones）、橙皮素（sinnensetin）、川陈皮素（nobe-litin）。

相关物质与分子结构对比见表1。

表1 相关物质与分子结构对比

这3 种物质之间分子量依次相差30，代表一个甲氧基，通过对m/z 403 进行多级串联质谱分析可得其结构关联性。

质荷比403 的多级串联质谱图见图3。

图3 m/z 403 多级串联质谱图

由图3 可知，川陈皮素易脱去1 个甲氧基得到橙皮素，不易脱去2 个甲氧基形成四甲氧基黄酮，推测质荷比343，373，403 不为同源化合物，而是在橙皮中共存的物质（MS2 质荷比403 cid30eV；MS2 质荷比403；MS2 质荷比373 cid 20eV）。白皮层中并不存在这3 种物质的特征峰，所以可以认定这3 种物质是特征存在于橙皮油胞层中的多甲氧基黄酮。

川陈皮素、橙皮素、四甲氧基黄酮结构关联式见图4。

图4 川陈皮素、橙皮素、四甲氧基黄酮结构关联式

2.2 DESI MSI

将冷冻后的橙皮沿横截面切割为厚0.5 mm 的薄片，用双面胶粘贴在载玻片上制成样片，然后将制好的切片放入二维移动平台，对选定区域进行全扫，扫描后依据质荷比信号强弱进行成像。橙皮切片平整程度、含水量、厚度对成像效果具有十分重要的影响。因此，切片厚度应大于0.5 mm，切割后应即刻进样，扫描时间不宜超过2 h。

成像结果显示，质荷比343.122 3，373.128 7，403.135 5 橙皮横截面该物质有明显分布差异，集中分布于橙皮的油胞层，白皮层分布较少，有明显的分界线且呈点状分布，由此推断出这些黄酮类化合物集中分布于橙皮的油胞层，而点状分布特征表明该物质可能存在于油胞层黄色颗粒内。iEESI MS 全扫谱图中得到质荷比343，373，403 信号强度最高且仅在外表皮中检测到，与成像结果一致，由此可以确定DESI-MS 成像物质为四甲氧基黄酮、橙皮素、川陈皮素。综合以上分析，橙皮中含量较高的3 种黄酮类化合物（四甲氧基黄酮、橙皮素、川陈皮素）在橙皮中均集中于油胞层，而且进一步推测得这类物质分布于外皮油胞层黄色颗粒内。

橙皮素、柚皮素、川陈皮素DESI MSI 成像图及橙皮横截切片光学图像见图5。

图5 橙皮素、柚皮素、川陈皮素DESI MSI 成像图及橙皮横截切片光学图像

3 结论

采用内部萃取电喷雾电离与表面解析电喷雾电离进行橙皮中黄酮类化合物分析，iEESI MS 结果表明，橙皮油胞层含有十分丰富的川陈皮素等黄酮类化合物，并通过多级串联质谱进行黄酮类化合物结构及共存性分析。DESI MSI 结果显示，川陈皮素、橙皮素、四甲基黄酮在橙皮横截面有明显的分布差异，而且集中分布于橙皮油胞层，在提取橙皮中有益物质时，以橙皮油胞层为原料以获得更好的提取效果，优化提取工艺，节约提取原料。采用直接质谱分析与成像相结合的方法，明确了橙皮油胞层含有的较多的四甲氧基黄酮、橙皮素及川陈皮素，直观表征了其不均衡分布现象，旨在为废弃橙皮利用提供新途径。