唐山地区CRE产新德里金属β-内酰胺酶亚型情况分析*

杨红梅，张淑青，刘 丽，白 静，孙 静，张巧玲，张晋玲，袁宝军△

开滦总医院:1.检验科；2.药剂科,河北唐山 063000；3.河北省唐山市玉田县医院检验科,河北唐山 064100

肠杆菌科细菌是临床常见的条件致病菌，可引起多个部位感染。碳青霉烯类药物抗菌谱广，是治疗产超广谱β-内酰胺酶或Ampc酶肠杆菌科细菌的首选用药，但是随着此类药物大量及不当使用，碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌(CRE)开始出现，且耐药率呈逐年上升趋势。由于CRE的治疗药物有限，患者病死率高，CRE已经严重威胁人类健康[1-3]。CRE的耐药机制包括产碳青霉烯酶、产超广谱β-内酰胺酶或Ampc酶合并膜孔蛋白缺失或突变、外排泵的存在。产酶是CRE的主要耐药机制。碳青霉烯酶分A、B、D 3类，A类和D类碳青霉烯酶其活性部位均需要丝氨酸,而B类金属酶需要锌来进行水解。新德里金属β-内酰胺酶(NDM)属于碳青霉烯酶中的B类金属酶，可以水解除氨曲南以外的β-内酰胺类抗菌药物。含此酶的细菌几乎对所有抗菌药物耐药，β-内酰胺酶抑制剂如舒巴坦、克拉维酸等也不能有效抑制该类金属酶[4]。NDM被报道以来，产NDM的耐药菌已在全世界广泛流行，NDM正在快速地演化，已出现NDM-17亚型的报道[5]。blaNDM是一种质粒携带的碳青霉烯耐药基因，可在各种病原体中广泛传播[6]，给临床抗感染治疗带来极大困难。不同地区在自然环境、经济条件、卫生条件及抗菌药物的使用等方面不同，这些因素都可能导致产NDM耐药菌的地区分布存在差异。本研究通过对唐山地区CRE进行blaNDM基因检测，了解本地区blaNDM基因的流行情况及流行趋势，为临床治疗和防控提供依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源 连续收集唐山地区规模较大的3所三级甲等综合医院2018-2019年临床分离的CRE非重复菌株252株。CRE判定依据美国临床实验室标准化协会 (CLSI)M100-S30标准，对碳青霉烯类药物(亚胺培南、美罗培南)任意一种非敏感。药敏质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705为阳性对照，ATCC BAA-1706为阴性对照。blaNDM阳性对照株为经DNA测序确认的大肠埃希菌。

1.2仪器与试剂 培养箱(Thermo Scientific)、Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统(法国生物梅里埃公司)、Bio-Rad PCR仪、电泳仪、Bioshine GelX 1850 凝胶成像仪(上海欧翔科学仪器公司)、药敏纸片(Oxoid公司)、M-H培养基(温州康泰生物科技有限公司产品)、乙二胺四乙酸(EDTA,索莱宝)、胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB，上海博微生物科技有限公司)、DNA提取试剂盒(北京天根公司)、引物合成(北京擎科生物科技有限公司)、2×Taq MasterMix (北京擎科生物科技有限公司)、DNA标志物(北京擎科生物科技有限公司)、替加环素E-test试条(法国生物梅里埃公司)。

1.3方法

1.3.1菌种鉴定 采用Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统进行试验。

1.3.2碳青霉烯酶表型筛选试验 采用改良碳青霉烯类灭活试验(mCIM)和EDTA协同改良碳青霉烯类灭活试验(eCIM)对CRE是否产酶以及产酶型别进行确证：取两管2 mL TSB肉汤,1管为mCIM试验管，另1管加入20 μL的0.5 mol/L EDTA溶液(终浓度为5 mmol/L)作为eCIM试验管。用1 μL接种环刮取满环血平板上过夜培养的受试菌株,分别加入上述两管TSB肉汤中,震荡混匀。将美罗培南纸片(10 μg) 浸入菌悬液中，35 ℃温育4 h。制备0.5麦氏浊度单位大肠埃希菌ATCC25922菌悬液并均匀涂布M-H琼脂平板。用10 μL接种环将美罗培南纸片取出并挤去多余菌液,贴至上述M-H琼脂板上,同一受试菌mCIM和eCIM试验管中的美罗培南纸片贴于同一M-H平板，35 ℃温育18～24 h,量取抑菌圈直径进行结果判断，药敏试验结果参照CLSI 2018年版的标准判读。

1.3.3耐药基因检测 采用DNA提取试剂盒提取细菌DNA，PCR扩增碳青霉烯酶基因NDM。参考文献[7]设计NDM引物，引物序列上游为5′-GGG CAGTCGCTTCCAACGG-3′，下游为5′-GTAGTGCTCAGTGTCGGCAT-3′，由北京擎科公司合成。PCR反应体系总体积25.0 μL，包括DNA模板3.0 μL，相应上、下游引物(50 μmol/L)各0.2 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 9.1 μL。94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，61 ℃退火延伸30 s，72 ℃延伸45 s ，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，用紫外凝胶成像与分析系统观察结果，PCR扩增产物送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，测序采用双向。测序结果用BLAST与GenBank已知序列比对以确定其基因型。

2 结 果

2.1mCIM和eCIM结果 252株CRE中245株mCIM阳性，7株阴性，PCR结果显示有243株含碳青霉烯酶，这些菌株mCIM均为阳性。mCIM灵敏度为100.0%,特异度为77.8%。252株CRE中75株eCIM阳性，177株阴性。76株产NDM的菌株mCIM均为阳性，74株eCIM为阳性。eCIM灵敏度为97.4%,特异度为99.4%。见表1～2。

表1 mCIM与PCR检测结果(n)

表2 eCIM与PCR检测结果(n)

2.2产NDM菌株的标本来源 76株产NDM菌株的标本类型主要是痰液(44.74%)，其次尿液(30.26%)、分泌物(13.16%)。产NDM-1菌株主要分离自呼吸道，产NDM-5菌株主要分离自泌尿系统和呼吸道。见表3。

表3 产NDM菌株标本类型分布[n(%)]

2.3NDM亚型及菌种分布 252株CRE经PCR扩增后发现76株含有blaNDM基因，NDM-5占60.53%(46株)、NDM-1占36.84%(28株)、NDM-9占2.63%(2株)。76株产NDM的肠杆菌科细菌中包括大肠埃希菌38株，占比最高，其他依次为肺炎克雷伯菌(29株)，产酸克雷伯菌(6株)，阴沟肠杆菌(3株)。见表4。

表4 NDM亚型及菌种分布[n(%)]

2.4药敏试验结果 仅发现2株CRE对替加环素耐药，1株为NDM-5，1株为NDM-9。产NDM菌株对氨曲南、阿米卡星、妥布霉素、复方磺胺甲噁唑的耐药率分别为77.6%、77.6%、89.5%、82.9%；产NDM-5菌株对氨曲南、阿米卡星、妥布霉素、复方磺胺甲噁唑的耐药率分别为84.8%、82.6%、93.5%、89.1%；产NDM-1菌株对氨曲南、阿米卡星、妥布霉素、复方磺胺甲噁唑的耐药率分别为64.3%、67.9%、82.1%、82.1%。发现4株产NDM-5菌株对美罗培南敏感，产NDM-9菌株除了替加环素外，对其他药物全部耐药。见表5。

表5 NDM及其亚型的耐药率[%(n/n)]

续表5 NDM及其亚型的耐药率[%(n/n)]

2.5部分产NDM菌株典型电泳图 对76株携带耐药基因blaNDM的肠杆菌科细菌进行具体分型后发现，其中28株为blaNDM-1，46株为blaNDM-5，2株为blaNDM-9。见图1。

注：M为标志物；Neg为阴性对照；Pos为阳性对照；方框选取的第5、8、10泳道为阳性菌株，相对分子质量为782 bp。

3 讨 论

产碳青霉烯酶是CRE的主要耐药机制。我国流行的碳青霉烯酶主要是KPC-2酶，NDM型碳青霉烯酶的检出率近几年呈上升趋势。2012—2016年，NDM的检出率迅速增加，从12%上升到28%[8]。ZHANG等[9]通过对中国25个地区1 105株CRE进行调查，发现CRE中产NDM的占比是32%。本研究从252株CRE中检测出76株产NDM菌株，NDM占比为30.16%(76/252)，与ZHANG等[9]的报道接近。

本研究252株CRE中245株mCIM阳性，75株eCIM阳性。表型筛选试验与PCR结果一致性较高，灵敏度、特异度高于相关报道[10]。76株产NDM的CRE涉及4个菌种，以大肠埃希菌为主，其次是肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、阴沟肠杆菌。不同菌种携带的亚型不同，大肠埃希菌主要携带NDM-5，肺炎克雷伯菌主要携带NDM-1。产NDM菌株来自临床多种类型标本，可引起患者多个部位的感染，因此阳性菌株患者一定要及时隔离，做好多重耐药菌的防治措施，避免CRE进一步扩散。呼吸道是主要检出途径，其次是泌尿系统。同时，不同标本来源的NDM亚型分布不同，呼吸道主要携带的是NDM-1，其次是NDM-5,泌尿系统则主要是NDM-5。

本研究证实唐山地区NDM亚型主要是NDM-5和NDM-1，仅发现2株NDM-9。这与杨勇文等[11]报道的武汉地区流行的NDM亚型不同，证实NDM亚型的分布具有地域性区别。46株产NDM-5的菌株中，30株为大肠埃希菌，11株为肺炎克雷伯菌，NDM-5主要存在于大肠埃希菌中。这提示可以通过CRE的菌种推测NDM亚型，提前做好防控对策，避免疾病的暴发、流行。NDM-5是NDM-1的变异体，由NDM-1的两个氨基酸发生改变进化而来，首次在大肠埃希菌中检出[12]。CHEN等[13]在2016年通过对中国4个区域上并无关联的城市研究发现，NDM-5在我国各地广泛传播，彼此间并无关联，既可以引起院内感染，也可以引起社区感染。NDM-1共检出28株，涉及3个菌种，以肺炎克雷伯菌为主。NDM-9只检出2株，由分离自痰液标本的阴沟肠杆菌携带。NDM-9对β-内酰胺类抗菌药物，尤其是碳青霉烯类抗菌药物的亲和力、水解能力更高，这与以往报道一致[14]。有研究报道，从环境中分离出此亚型，说明此亚型传播范围更广，要做好预防措施[15]。

76株携带NDM的CRE耐药性严重，除了对氨曲南、阿米卡星、妥布霉素、复方磺胺甲噁唑部分敏感外，对其余抗菌药物几乎全部耐药。NDM属于碳青霉烯酶中的金属酶，金属酶不能有效水解氨曲南，通过对本地区CRE进行药敏试验分析发现，氨曲南呈高水平耐药，可能产NDM菌株同时携带其他β-内酰胺类耐药基因如blaTEM、blaSHV、blaCTX等[16]。本研究中NDM-1和NDM-5亚型间耐药性存在差异，NDM-9菌株较少不纳入比较。有研究指出，NDM-5携带的V88L使NDM-5酶的活性增强，对碳青霉烯类药物的最小抑菌浓度(MIC)值是NDM-1的4～8倍[17]，此外，NDM-5常携带多种耐药基因[18]，因此NDM-5的耐药性更强。本研究中NDM-5耐药率高于NDM-1，这与已有的报道一致[19]。因此。临床应高度关注产NDM-5菌株。目前针对CRE的治疗多采用联合用药，尤其是以碳青霉烯类药物为基础的联合用药[20]，本研究发现该菌对阿米卡星、妥布霉素的耐药率相对较低，而替加环素灵敏度更高，均可作为联合用药的选择。

综上所述，唐山地区CRE产生的NDM有3种不同的亚型,以NDM-5和NDM-1为主，主要由大肠埃希菌携带，感染途径主要是呼吸道和泌尿系统。唐山地区NDM亚型呈多样性变迁且耐药性严重，临床应高度关注。