血清miR-125b-5p、miR-146a-5p表达水平与乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭患者预后的相关性研究*

常凤霞，蔡 薇，巴晓丽，董 力，马维兰

1.青海省第四人民医院检验科，青海西宁 810000；2.青海大学附属医院检验科，青海西宁 810001；3.青海大学附属医院急诊内科，青海西宁 810001

慢加急性肝衰竭(ACLF)是慢性肝病的一种严重并发症，常见病因为病毒性肝炎，尤其以乙型肝炎居多，临床称之为乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)[1]。这类患者的临床表现包括腹水、黄疸、凝血障碍等，发病机制与多种因素如代谢、病毒、宿主等有关[2]。HBV-ACLF具有病情进展快、病情严重等特点，容易诱发出血、感染、电解质紊乱等并发症，病死率较高[3]。既往大多通过检测肝功能、血常规等血清生物学指标评估肝损伤患者的病情，虽然以上方法具有一定价值，但干扰因素较多，如油腻食品、运动、熬夜等，可导致其缺乏特异性，且无法对预后进行预测。因此，临床还需寻求更理想的指标以进一步了解ACLF的进展机制，为预测预后提供依据。近年的研究发现，微小核糖核酸(miRNA)与肝损伤发生有关，例如miR-125b-5p与慢性肝炎发病密切相关，随着病情进展，血清miR-125b-5p表达水平呈升高趋势[4]。另有研究提示，miR-146a-5p可经负反馈对炎症进行抑制，能调节肝病患者的免疫功能[5]。由此可见，miR-125b-5p、miR-146a-5p可能均与肝损伤的进展有关，但其对预后的影响机制尚不明确。基于此，本研究通过分析血清miR-125b-5p、miR-146a-5p表达水平与HBV-ACLF患者预后的关系，以期为临床HBV-ACLF的诊治提供新思路，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 纳入青海省第四人民医院2016年7月至2019年7月收治的80例HBV-ACLF患者进行前瞻性研究。其中男43例，女37例；年龄44～78岁，平均(60.02±12.53)岁；并发症：消化道出血15例，肺部感染12例，腹膜炎13例，肝性脑病12例。HBV-ACLF的诊断参考《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[6]与《肝衰竭诊治指南(2012年版)》[7]相关标准：既往有慢性乙型肝炎病史，短期内出现亚急性或急性肝功能失代偿症状，包括(1)乏力、消化道表现(如恶心、呕吐、腹痛、饱胀感等)；(2)黄疸加深，总胆红素(TBil)每日升高超过17.1 μmol/L或升高超过正常范围上限10倍；(3)伴出血倾向；(4)有或无肝性脑病；(5)腹水。纳入标准：(1)满足上述关于HBV-ACLF的诊断标准；(2)入院后均行常规的肝功能、血常规以及相关实验室检查；(3)病历资料齐全。排除标准：(1)因其他肝病引起的ACLF者；(2)恶性肿瘤者；(3)肾、心等脏器严重受损者；(4)妊娠期女性；(5)自身免疫性肝病、酒精性/药物性肝病者；(6)高血压、糖尿病等病情控制欠佳者。本研究通过医院伦理委员会审核，所有患者均自愿签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1血清miR-125b-5p、miR-146a-5p检测 采集2 mL空腹肘静脉血，存放于-20 ℃冰箱待测。(1)提取RNA：取Trizol 1 mL加入试管使细胞裂解，取氯仿200 μL加入，振荡15 s，在室温环境下反应3 min，于4 ℃下以3 200 r/min离心15 min，吸取上层水相置于提前备好的离心管内。取异丙醇加入试管，混合充分，在室温下反应10 min，再次在4 ℃下以3 200 r/min离心10 min，使RNA沉淀。弃上清液，75%乙醇对沉淀物洗涤2次，在室温下反应10 min，取无RNA酶水加入，促进溶解，对RNA水平进行调整。(2)行反转录-荧光定量PCR测定，反应条件如下：95 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，45个循环；95 ℃ 60 s；60 ℃ 60 s；70.0～98.5 ℃，每隔10 s升高0.5 ℃，58个循环；26 ℃ 10 s。将U6视作内参基因，各基因引物序列分别如下：U6上游序列为5′-TGGAAAGGACGAAACACCGT-3′，下游序列为5′-ATTTGCGTGTCATCCTTGCG-3′[8]；miR-125b-5p上游序列为5′-ATTTGAGCTACAGCACGGTCGA-3′，下游序列为5′-GGCTAGTGAAGTTTACCCCCTGC-3′[9]；miR-146a-5p上游序列为5′-ACTGCAAGGAGGGGTCTTTG-3′，下游序列为5′-CAAGCCCACGATGACAGAGA-3′[10]。用2-ΔΔCt表示目标基因的相对表达量。待循环完毕，分析溶解曲线，检测温度控制为70～95 ℃。

1.2.2肝功能指标检测 另取空腹静脉血2 mL，行离心处理，离心时间15 min，转速3 000 r/min，离心半径10 cm，分离血清，存放在-20 ℃冰箱待测。经全自动生化分析仪(北京博科技术股份有限公司，BK-400)测定血清TBil、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、清蛋白(ALB)水平。

1.2.3其他指标检测 采用荧光定量PCR试剂盒(上海晅科生物科技有限公司)测定HBV-DNA，采用血细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，BC-5000)测定外周血白细胞计数(WBC)、血小板计数(PLT)、中性粒细胞绝对值(NE)。采用全自动生化分析仪(厂家、型号同上)测定血肌酐(Cr)水平，经电化学发光检测法(试剂由广州博康生物技术有限公司提供)测定凝血酶原时间(PT)，从而计算凝血酶原活动度(PTA)。PTA=[对照PT-(对照PT×0.6)/患者PT-(对照PT×0.6)]×100%。

1.2.4随访 对所有患者进行为期1年(从入院治疗时起至1年后止)的随访，随访方式为门诊复查或电话随访。

1.2.5生存、死亡亚组的分析比较 根据患者1年的预后情况，分成生存组、死亡组。比较两组血清miR-125b-5p、miR-146a-5p表达水平及其他血液指标水平。

2 结 果

2.1生存资料概况 80例患者经1年跟踪随访，生存59例、死亡21例。病死率为26.25%。以各患者的生存时间建立的Kaplan-Meier生存曲线，见图1。

图1 80例HBV-ACLF患者的Kaplan-Meier生存曲线

2.2两组临床资料比较 死亡组NE、TBil、AST、ALT水平以及消化道出血、肝性脑病占比高于生存组(P<0.05)，两组性别、年龄、WBC、PLT、HBV-DNA、肺部感染占比、腹膜炎占比、ALB、Cr、PTA比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组临床资料比较

续表1 两组临床资料比较

2.3两组血清miR-125b-5p、miR-146a-5p表达水平比较 死亡组血清miR-125b-5p表达水平高于生存组，而miR-146a-5p表达水平低于生存组(P<0.05)，见表2。

表2 两组血清miR-125b-5p、miR-146a-5p表达水平比较

2.4两组血清miR-125b-5p、miR-146a-5p表达水平与肝功能指标的相关性 Pearson相关分析显示，血清miR-125b-5p表达水平与TBil、AST、ALT呈正相关(P<0.05)，血清miR-146a-5p表达水平与TBil、AST、ALT呈负相关(P<0.05)，血清miR-125b-5p、miR-146a-5p表达水平与ALB无相关性(P>0.05)，见表3。部分相关指标散点图见图2。

图2 HBV-ACLF患者的血清miR-125b-5p、miR-146a-5p表达水平与肝功能指标相关性的散点图(n=80)

2.5影响HBV-ACLF患者预后的多因素分析 建立COX比例风险回归模型，以预后状况为因变量，赋值1=死亡，0=生存，t=生存期。以前述单因素分析(表1和表2)中P<0.05的指标/因素为自变量。考虑到样本量尤其是阳性样本量较少，经与临床和统计专业的专家会商，将其中影响作用熟知的ALT、ALB两指标剔除，不纳入回归。此外，将部分为连续数值的自变量，参考两组中位值进行分段(分层)，转化成二分类变量，以提高统计效率并使回归结果清晰。各变量赋值见表4。回归过程采用逐步后退法，以进行自变量的选择和剔除，设定α剔除=0.10，α入选=0.05。结果显示，消化道出血、肝性脑病及血清miR-125b-5p、miR-146a-5p表达水平是HBV-ACLF患者预后的影响因素(P<0.05)。

表3 两组患者血清miR-125b-5p、miR-146a-5p表达水平与肝功能指标的相关性

2.6血清miR-125b-5p、miR-146a-5p对HBV-ACLF预后的评估价值 进一步探讨血清miR-125b-5p、miR-146a-5p对HBV-ACLF预后的评估价值，采用两种方法进行分析。(1)两指标的单独应用：以死亡组为阳性样本，以生存组为阴性样本，建立ROC曲线诊断分析模型，并采用组段建模模式。被分析指标按样本总水平数值范围划分为若干个组段，建立ROC曲线(折线)。再以软件拟合ROC曲线，读取约登指数最大值点，计算最佳临界值和灵敏度、特异度。经ROC曲线分析：两指标均具有较高的预后评估价值，曲线下面积(AUC)分别为0.733(95%CI0.597～0.869)、0.741(95%CI0.618～0.865)。(2)两指标的联合应用：采用SPSS23.0软件联合ROC曲线理论模式(LogP模式，对各单独应用指标进行综合回归，建立Logistic预测/诊断评估模型，再依据所得回归系数，归一化加权，计算并对应处理各样本资料，进行两指标联合应用的ROC曲线分析)。结果提示，联合应用对HBV-ACLF预后的评估价值较高，AUC为0.845(95%CI0.736～0.955)，比单一指标检测明显提高，见表5、图3。

图3 血清miR-125b-5p、miR-146a-5p预测HBV-ACLF预后的ROC曲线

表4 影响HBV-ACLF患者预后的COX比例风险回归模型

表5 血清miR-125b-5p、miR-146a-5p对HBV-ACLF预后的评估价值

3 讨 论

HBV-ACLF病情进展迅速，死亡风险较高，这类患者具有个体差异大、发病诱因复杂等特点，目前尚无特效方案治疗，主要通过对症干预、积极预防或治疗并发症等方式缓解症状，延缓病情进展[11]。尽早了解患者病情，判断死亡风险对改善预后至关重要。既往常通过评估肝功能、Cr、PTA等指标，了解HBV-ACLF进展情况，但灵敏度与特异度并不理想[12]。目前，研究发现部分miRNA在肝脏疾病中存在特异性表达，例如薛扬等[13]研究提示，ACLF患者的血清miR-130a表达水平升高，其与患者预后密切相关。高飞等[14]也发现，miR-130a在ACLF患者血清中呈高水平表达，且与患者预后有关。但总体而言，关于这类患者miRNA表达水平的报道较少，且所选择的指标比较局限，临床仍需增设相关指标进行分析。随着医学研究进展，有学者指出，miR-125b-5p、miR-146a-5p在肝脏疾病中发挥了一定作用，与肝损伤、肝脏代谢、肝脏发育密切相关，可能影响疾病的进展、转归[15]。故临床可考虑利用二者评估HBV-ACLF患者预后，为临床诊疗提供依据。

本研究结果显示，与HBV-ACLF生存者相比，死亡患者的血清miR-125b-5p表达水平明显升高，而miR-146a-5p表达水平下降，表明血清miR-125b-5p、miR-146a-5p可能影响预后。miR-125b-5p是miRNA中的重要成员，具备促进细胞吞噬的功能，随着肝损害程度加重，miR-125b-5p异常表达越明显[16]。miR-125b-5p导致肝损伤加重的机制可能在于，其过表达可对血管内皮生长因子及金属蛋白酶进行靶向介导，加重肝损害，此外，其异常表达还可下调还原酶P450活性，使还原化途径阻断，引起肝细胞功能紊乱，导致肝损伤加重[17]。由此可见，血清miR-125b-5p可能是HBV-ACLF患者死亡风险增加的潜在预后生物标志物。miR-146a-5p在多种恶性肿瘤中均存在异常表达，如在胃癌、前列腺癌中表现为低表达，而在甲状腺癌、黑色素瘤中呈高表达，具体机制尚不明确[18]。这提示miR-146a-5p在不同疾病中的表达存在特异性，临床需予以重视。本研究提示，miR-146a-5p低表达可增加HBV-ACLF患者的死亡风险，间接表明其对肝功能可能有保护作用。有研究指出，miR-146a-5p能降低白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α水平，从而达到抑制炎症的目的[19]。miR-146a-5p表达水平较高的HBV-ACLF患者可能因炎症较轻，能减轻肝损害，而表达较低的患者炎症较重，加重了肝损害，继而增加死亡风险。本研究还观察了二者与肝功能的相关性，结果提示血清miR-125b-5p表达水平与TBil、AST、ALT呈正相关，而血清miR-146a-5p表达水平与三者呈负相关(P<0.05)。这进一步证实血清miR-125b-5p表达水平越高，患者的肝损害越重，而miR-146a-5p表达水平越低，患者肝损害越重，其表达水平越高，则有利于保护肝功能。

本研究结果显示，血清miR-125b-5p、miR-146a-5p对HBV-ACLF患者的预后具有一定的评估价值。肝衰竭的主要特点在于肝细胞坏死，这也是增加死亡风险的重要原因，对预后影响极大[20]。有研究发现，miR-125b-5p过表达能促进肝细胞凋亡及坏死，机制可能在于其有利于乙型肝炎表面抗原编码区序列的靶向聚合，参与宿主被病毒侵袭的过程[21]。miR-125b-5p可能通过过表达的这一机制，影响HBV-ACLF患者预后。miR-146a-5p则可通过对多种炎症因子进行调控，发挥其抑制炎症的作用，缓解肝损伤，而一旦miR-146a-5p表达水平降低，则可能促进炎症因子释放，导致肝损伤患者的炎症加重，进一步损害肝功能，从而影响预后[22]。在未来的HBV-ACLF治疗中，临床可将miR-125b-5p、miR-146a-5p作为靶向基因，据此研究新的治疗思路。此外，本研究经COX比例风险回归模型分析证实，消化道出血、肝性脑病及血清miR-125b-5p、miR-146a-5p是患者预后的影响因素。消化道出血、肝性脑病均为肝衰竭患者的严重并发症，已有研究证实二者为肝病患者预后的影响因素[23-24]。miR-125b-5p过表达可能通过影响还原酶P450活性，参与宿主被病毒侵袭等过程，促进肝损害。而miR-146a-5p低表达可能通过促进炎症介质释放，加重机体炎症，促进肝损害。二者均与肝功能受损密切相关，能加重HBV-ACLF患者病情严重程度，导致死亡风险加大。

综上所述，与HBV-ACLF生存者相比，死亡者的血清miR-125b-5p表达水平明显上调，而miR-146a-5p表达水平下调，二者与血清TBil、AST、ALT均有相关性，可作为预后评估的重要指标。此外，本研究也有不足之处，如仅选择80例样本且仅观察了1年的预后，未来还需延长随访时间，对此进行多中心、大样本的研究。