高糖条件下Exendin-4对骨髓间充质干细胞增殖分化的影响

石晓娜 周麟 张悦 陈莉媛 罗静雯 郑新城 林东

糖尿病是口腔种植修复的高风险因素。由于高血糖损害成骨细胞功能，减少骨转化，影响种植体周围骨结合[1-3], 因此糖尿病是牙种植修复的一个难题。

肠促胰素类药物是2型糖尿病的一种常用治疗药物，主要包括胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物和二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂。有研究发现肠促胰素类药物不仅有控制血糖的作用，还能通过促进骨形成，抑制骨吸收两方面影响糖尿病患者的骨代谢[4-6]。有研究表明GLP-1能通过增强Wnt/β-catenin通路促进成骨细胞的增殖分化，亦能与脂肪间充质干细胞上的GLP-1受体结合诱导脂肪间充质干细胞向成骨细胞分化，从而促进骨形成[7]。

艾塞那肽(Exenatide)主要成分为Exendin-4。Exendin-4是一种从北美希拉巨蜥唾液中发现的长效GLP-1受体激动剂。它和GLP-1具有相似的生理功能，能调节血糖,保护胰岛β细胞[8]。本实验以大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)为研究对象,观察Exendin-4对高糖条件下BMSCs增殖分化的影响，以进一步探讨Exendin-4对2型糖尿病骨代谢及种植体周围骨结合的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

(200±20) g 雄性SD大鼠(福建医科大学动物实验中心)；Exendin-4(Sigma公司， 美国)；高糖DMEM培养基、低糖DMEM培养基(Hyclone公司， 美国)；ALP活性检测试剂盒、CCK-8溶液、Western及IP细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(Gibco公司， 美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠BMSCs的分离培养 180～220 g健康雄性 SD大鼠，脱颈处死，无菌条件下剥离股骨，收集骨髓细胞于10%FBS， 1%青链霉素双抗的低糖DMEM培养基中并接种于培养皿，放置在37 ℃ 5%CO2培养箱中培养， 3 d后换液，培养7 d后，细胞贴壁生长，呈较均匀梭形，长满90%左右，进行传代培养。选取生长良好的P4～P6细胞制成细胞悬液后分组培养，进行后续实验。实验分组：以BMSCs为实验对象，分为对照组(对照组，低糖DMEM培养基含糖5.6 mmol/L)；高糖组(HT组，高糖DMEM培养基 含糖25 mmol/L)；高糖联合不同浓度Exendin-4干预组(HG+E1组 Exendin-4 1 nmol/L，HG+E5组Exendin-4 5 nmol/L， HG+E10组Exendin-4 10 nmol/L，HG+E15组Exendin-4 15 nmol/L)。

1.2.2 大鼠BMSCs的增殖实验 BMSCs分组接种于24 孔板， 2×104/孔，每组设3 个平行孔。培养1、 3、 7 d后，弃去旧培养基，每孔中加入500 μL的新鲜培养基， 50 μL的CCK-8溶液。置于37 ℃细胞培养箱中，继续培养2 h。每孔吸取200 μL反应液至96 孔板中。在450 nm利用酶标仪检测其吸光度值,观察细胞的增殖情况。

1.2.3 细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性检测 BMSCs分组接种于24 孔板， 2×104/孔， 每组设3 个平行孔。培养7 d后，弃细胞上清液，PBS冲洗3次，加入100 μL裂解液1%的Triton X-100，进行4个冻融循环裂解细胞。ALP活性检测试剂盒测定裂解液中ALP活性，在405 nm测其吸光度值。

1.2.4 细胞外基质矿化检测 BMSCs分组接种于24 孔板，2×104/孔，每组设3 个平行孔。培养14 d后，弃细胞上清液，PBS冲洗3 次后，75%的酒精固定1 h， 40 mmol/L的茜素红(pH=4.2)细胞外基质染色10 min。去离子水漂洗试样5次直至不再脱色，体式显微镜照相。10%氯化十六烷基吡啶(溶剂为PBS缓冲液)溶解试样表面染料，在630 nm测其吸光度进行定量分析。

1.3 统计方法

应用 GraphPad Prism7和SPSS 16.0 软件进行统计分析。2 组之间定量数值比较采用独立样本t检验，多组之间定量数值比较采用单因素方差分析，检验水准 α=0.05，P<0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1 BMSCs细胞培养

分离得到的骨髓细胞呈圆形, 大小不一，含少许杂细胞， 72 h后换液可见细胞贴壁生长， 5～6 d后细胞增殖迅速， 10～12 d时细胞达90%融合,细胞呈梭形。传代培养后，细胞状态渐趋稳定，取生长状态较好的P4代细胞进行实验(图 1)。

图 1 BMSCs倒置显微镜下形态

2.2 Exendin-4 对BMSCs增殖的影响

培养1、 7 d时，与对照组相比,HT组BMSCs的增殖能力均受到明显抑制(P<0.05)。与HT组相比，Exendin-4在短时间干预(1～3 d)时，未见其对高糖条件下BMSCs增殖的影响，而长时间干预(7 d)时，低浓度(1 nmol/L)Exendin-4可略增加高糖培养的BMSCs增殖，但无统计学意义，而高浓度(15 nmol/L)Exendin-4 在3、 7 d时均对BMSCs增殖有显著抑制作用(P<0.05)(图 2)。

图 2 Exendin-4对高糖诱导的BMSCs增殖的影响

2.3 Exendin-4 对BMSCs ALP活性的影响

ALP活性检测结果(图 3)显示：与对照组相比，HT组BMSCs 的ALP活性无明显改变(P>0.05);与HT组相比，HG+E1组BMSCs ALP活性显著增高(P<0.01)，HG+E5、HG+E10、HG+E15组BMSCs ALP活性与HT组相比有增高，但未见统计学意义。

图 3 Exendin-4对BMSCs ALP活性的影响

2.4 Exendin-4 对BMSCs向成骨细胞分化时钙沉积量的影响

培养14 d后，对细胞进行茜素红染色(图 4)后观察见：对照组矿化结节出现较少，HT、HG+E1、HG+E5、HG+E10、HG+E15组均出现成骨细胞矿化结节；半定量检测(图 5)结果显示：15 nmol/L的Exendin-4可显著抑制高糖培养下BMSCs的钙沉积量(P<0.01)。

图 4 BMSCs 不同浓度Exendin-4干预14 d茜素红染色(×40)

图 5 BMSCs茜素红染色半定量分析

3 讨 论

随着人们生活条件不断提高，糖尿病的患病率也迅速提高。据2010流行病学调查，我国成年人糖尿病患病率为11.6%，糖尿病前期患病率为50.1%[9]。糖尿病是影响牙种植修复的一个高风险因素，其高糖环境不利于骨髓间充质干细胞发挥功能，减少成骨转化，影响种植体周围骨结合。GLP-1类药物是一类在临床上广泛应用的降糖药物。有研究发现GLP-1激动剂可促进骨形成，抑制骨吸收，增强骨材料性能[10]。 Pereira等[11]发现Exendin-4可以改善糖尿病大鼠骨增量。

种植体周围骨结合的关键是骨髓间充质干细胞的成骨分化。成骨细胞的分化过程包括增殖、细胞外基质矿化、成熟等[12]。碱性磷酸酶来源于成骨细胞的分泌，其活性代表了成骨细胞的矿化能力，是成骨细胞分化成熟的早期标准之一[13]。成骨细胞可形成矿化结节，矿化结节若经茜素红染色呈红色,说明体外培养的BMSCs有分化为成骨细胞的趋势[14]。因此为探讨高糖条件下 Exendin-4 能否促进 BMSCS的增殖、成骨分化，增加骨形成，本研究对BMSCs细胞进行了CCK-8增殖实验以及对细胞碱性磷酸酶和矿化结节两种成骨标志物进行了检测。

有多位学者研究发现Exendin-4可促进BMSCs增殖分化，且其促进作用随Exendin-4浓度增加而增强[15-17]。而本实验通过检测细胞增殖发现：细胞培养1、 3 d时，高糖条件下，Exendin-4对BMSCs的增殖能力无明显促进作用。此结果与Paola等学者研究发现的Exendin-4短期干预(24、 48、 72 h)不影响MSC的增殖相似[18]。 7 d时，低浓度(1 nmol/L)Exendin-4可略增高高糖下BMSCs的增殖能力，但未见统计学意义，可能需要进一步延长干预时间，而高浓度Exendin-4 (15 nmol/L)对高糖条件下BMSCs的增殖能力有明显的抑制作用。ALP检测结果示高糖条件下， Exendin-4 1～15 nmol/L干预下BMSCs均有向成骨细胞分化的趋势，具有成骨活性，其中，Exendin-4 1 nmol/L时其对BMSCs的成骨分化效应最佳；茜素红染色半定量分析示14 d时，各组细胞基质均出现矿化结节，Exendin-4 15 nmol/L对BMSCs成骨分化成熟有抑制作用。

综上研究发现，经过较长时间的高糖培养和Exendin-4干预，高浓度(15 nmol/L)Exendin-4可抑制细胞增殖与分化成熟,而低浓度的Exendin-4对BMSCs的增殖能力虽无明显促进作用但可促其成骨细胞标志物ALP分泌增加。此结果说明在较长时间低浓度Exendin-4干预下BMSCs ALP浓度的升高并非由细胞数量增多所致，而可能通过低浓度Exendin-4促进细胞成骨相关通路而使分泌增加。有研究发现Exendin-4能通过Wnt/β-catenin、Hedgehog/Gli1、PKA-STAT3通路、RANKL/RANK/OPG 系统等途径促进BMSCs增殖分化[19-20]。因此要明确低浓度Exendin-4促进细胞ALP分泌增加的途径，还需后续实验探索其机制。此外，除ALP外，OCN也是骨细胞成熟的重要评价指标之一，而RUNX是成骨分化过程中的必要因子，它能调控OCN转录因子的表达，增加RUNX2基因的表达，就能够增强BMSCs向成骨细胞的诱导[21-23]。所以为进一步完善实验，本课题还需通过定量检测OCN、RUNX2基因对应的mRNA进行研究。