广东省揭阳市2018—2020年细菌性食物中毒的病原学检测结果分析

黄晓平，翁奕敏，史煜曼

(揭阳市疾病预防控制中心，广东 揭阳 522031)

食源性疾病是指通过摄食而进入人体的有毒有害物质(包括生物性病原体)等致病因子所造成的疾病。食源性疾病的发病率居各类疾病总发病率的前列，是当前世界上最突出的卫生问题。根据WHO的资料显示，在食源性疾病危险因素中，细菌性食物中毒发生率居各类食物中毒的首位[1]。引起食物中毒的主要原因是微生物性食物中毒[2]，同时它引起发病的人数最多[3-4]。近几年来，随着本地人民生活水平的不断提高，饮食结构与饮食习惯多样化，食物中毒事件时有发生，且多为细菌性食物中毒，对人民的健康构成极大的威胁。现就揭阳市2018—2020年发生的细菌性食物中毒实验室检测结果进行分析，发现并掌握病原菌的流行特征，为有关部门制定防控措施和进行健康宣传教育提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源所有检测样本均来自2018—2020年发生的细菌性食物中毒采集的患者肛拭子或粪便标本、胃内容物、尿液和血液、剩余食物、外环境涂抹液。收集送检单，原始记录和检测报告，整理数据进行分析。

1.2 培养基和诊断血清试剂缓冲蛋白胨水、TTB增菌液、SC增菌液、1 g·L-1蛋白胨水、75 g·L-1氯化钠肉汤、EC肉汤、志贺氏增菌肉汤、牛奶发酵培养基、乳糖-明胶液化试剂、动力-硝酸盐试剂、B-P平板、MYP平板购于广东环凯生物技术有限公司。BS平板、TCBS平板、TSI试剂、MAC平板、TSC平板、FTG平板、血浆凝固酶试剂、IMVIC试剂盒、蜡样芽孢杆菌生化鉴定试剂盒购于北京陆桥技术股份有限公司，沙门菌显色平板、志贺菌显色平析、弧菌显色平板购于上海欣中生物工程有限公司(法国科玛嘉)，血平板购于广州迪景微生物科技有限公司，致泻大肠埃希菌PCR检测试剂盒购于深圳生科源有限公司，API生化鉴定条购于法国生物梅里埃股份有限公司，沙门菌诊断血清购于广州健仑生物公司(丹麦SSI)，志贺菌诊断血清购于宁波天润公司。所有试剂和诊断血清均在有效期内使用。

1.3 检验方法

1.3.1标准 依照GB 4789.1—2010《食品微生物学检验总则》[5]、GB 4789.10—2010 《金黄色葡萄球菌检验》[6]、GB 4789.14—2014 《蜡样芽胞杆菌检验》[7]、GB 4789.4—2016 《沙门氏菌检验》[8]、GB 4789.5—2012 《志贺氏菌检验》[9]、GB 4789.6—2016《致泻大肠埃希氏菌检验》[10]、GB 4789.13—2012《产气荚膜梭菌检验》[11]、GB 4789.7—2013《副溶血性弧菌检验》[12]。

1.3.2提取 细菌基因组DNA提取菌株经纯化培养后采用QIAamp DNA纯化mini试剂盒进行全基因组DNA提取，待测DNA置-20 ℃冰箱备用。

1.3.3全基因组测序及数据处理 由北京诺禾致源科技公司采用Illumina NovaSeq二代测序平台完成细菌全基因组测序。测得的原始序列数据使用CLC Genomics Workbench 20.0(QIAGEN)软件对序列数据进行质控、过滤和denovo组装等处理，最后获得每个菌株的contigs文件。

1.3.4耐药基因分析 使用Center for Genomic Epidemiology(CGE; https://cge.cbs.dtu.dk/)在线分析工具ResFinder 3.2(https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)对菌株的全基因组序列进行比对分析，获得菌株的耐药基因携带情况。

1.3.5MLST分型 将全基因组序列上传至PubMLST数据库，根据沙门菌7个管家基因aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA和thrA方案进行比对分析，获得每株菌所属MLST型别。

1.4 统计学分析检验结果导入Excel 2007进行描述性统计分析，用SPSS 10.0进行分析，采用χ2检验对食物中毒检出率和不同样品致病菌检出率进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病原菌年度检出情况2018—2020年共检测样本70份，其中，2018年检出阳性样本10份，2019年检出阳性样本26份，2010年检出阳性样本13份，各年的检出率分别为66.66%，78.78%和59.09%，各年间的检出率差异无统计学意义(χ2=1.374，P>0.05)。

2.2 各季度食物中毒病原菌检出情况2018—2020年第1、2、3季度均检出病原菌，第4季度无细菌性食物中毒事件发生。主要集中在第2季度，共检出57份菌株，阳性率为81.42%(57/70)，见表1。

表1 揭阳市食物中毒病原菌四季分布情况(株)

2.3 各年致病菌的检出情况49份阳性样本中，共检出副溶血性弧菌、沙门菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌共5种致病菌。其中副溶血性弧菌的检出率最高，检出率为48.57%，其次为沙门菌，检出率为22.85%，检出5株混合感染菌株，检出率为7.14%，产气荚膜梭菌检出2株，检出率为2.85%，金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌均检出1株，检出率为1.41%。致泻性大肠埃希氏菌和志贺菌均未检出，见表2。

表2 揭阳市细菌性食物中毒致病菌检测情况[n(%)]

2.4 不同类型样本致病菌的检出情况70份疑似细菌性食物中毒样本包括肛拭子、粪便、可疑食品、血液、尿液、胃内容物、外环境涂抹液。肛拭子检出率最高，为85.72%。各样本间的检出率差异有统计学意义(χ2=9.363，P<0.05)。见表3。

表3 2018—2020年揭阳市各类送检样本检出致病菌的情况

2.5 沙门菌的血清学分型情况对16株沙门氏菌进行血清学分型，其中，2018年检出的4株沙门氏菌均为德尔卑沙门氏菌，2020年检出的12株沙门氏菌，6株是鼠伤寒沙门氏菌，6株是韦太夫雷登沙门氏菌。 挑取2020年检出的3株鼠伤寒沙门氏菌和5株韦太夫雷登沙门氏菌进行全基因组测序和MLST分型，鼠伤寒沙门氏菌为ST19型，韦太夫雷登沙门氏菌为ST365型。鼠伤寒沙门氏菌携带多种耐药基因，耐药表型是甲氧苄啶、大环内酯、利福平、喹诺酮、磺酰胺、氨基糖苷四环素、β-内酰胺。韦夫太雷登沙门菌的耐药表型是阿米卡星。

3 讨论

揭阳市细菌性食物中毒的检测结果分析显示，食物中毒的主要致病菌是副溶血性弧菌，检出率为48.57%，低于珠海市(78.23%)，高于广东其他地区[13-16]。由于揭阳市是沿海城市，海产品丰富，且人们有生吃盐渍海鲜的习惯，大大提高了食物中毒的风险，有关部门应加强餐饮业的食品卫生监督，强调食物要煮熟、煮透，并多进行宣教工作，建议市民不生吃海产品。沙门菌的检出率为22.85%，高于张海英[17]的报道，血清型为德尔卑沙门菌、鼠伤寒沙门菌、韦太夫雷登沙门菌。文献少见对食物中毒沙门菌进行血清分型，这对沙门菌不同血清型的流行病学分析提供了一定的数据，自从2009年揭阳市首次报道了一起韦太夫雷登沙门菌污染水果刨冰引起的食物中毒后[18]，这是第2次在食物中毒事件中检出该血清型沙门菌，提示可进一步对该菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)同源性分析，分析这两起事件是否具有关联性，丰富揭阳市食物中毒沙门菌血清型流行病学资料。鼠伤寒沙门菌携带多种耐药基因，多重耐药情况严重，这与文献[19]的研究一致，提示要警惕鼠伤寒沙门菌引起的食源性疫情暴发。检出5株混合感染菌株，4株是副溶血性弧菌和沙门菌的混合感染，1株是金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌的混合感染。沙门菌主要污染肉类食品，鱼、禽、奶、蛋类食品也可受此菌污染，患者若未把食物煮熟、煮透，则很容易感染此菌，提示除海产品外，其他类食品也要煮熟、煮透方可进食。产气荚膜梭菌对人致病的主要是a型，引起气性坏疽和食物中毒，金黄色葡萄球菌引起食物中毒是其产生的肠毒素，本文缺少对菌株分型和肠毒素检测的研究，以后应从仪器设备和提高实验人员检测能力等方面多投入建设，大力提高揭阳市疾病中心检测能力。本次检测中检出1株蜡样芽孢杆菌，该菌株检自市售珍珠奶茶引起的食物中毒，菌落数<105g-1，未达到引起中毒的剂量，可能是食品采样人员达到现场时，现场已被处理过，难以采集到可疑食品及污染环节样品，造成样品检出率低。提示要提高经营者卫生知识培训，出现疑似食物中毒事件立即封锁现场，确保疑似污染样品不被清理掉。采样人员要提高采样能力，与检验人员沟通，根据患者症状和流行病学特点，有针对性地采集有价值的样本，提高检出率。

2018—2020年食物中毒集中发生在第2季度，与广东省其他地级市报道基本一致[20-21]，可能是因为这个季节温度较高，湿度大，细菌繁殖快，细菌性食物中毒事件频发。食品监督部门应在食物中毒高发季节重点加强饮食和食品加工等行业的监管，严格要求餐饮从业人员健康体验，持证上岗。

揭阳市2018—2020年发生的细菌性食物中毒采集的标本比例很不合理，80%是患者的肛拭子，只有8.57%是粪便样本，其他类型样本比率更低。各种致病菌检出率存在明显差异，分析有以下几方面原因：(1)采样人员到达现场后，患者粪便、呕吐物、剩余食品、可疑外环境样本大部分已被清理，只能采集患者肛拭子，因其最能直接反映患者身体肠道消化状况且有采样方便的特点而被广泛采检，同时若患者在采检前未服用抗生素，都有较高的检出率；(2)粪便等其他类型样本比率少，原因可能是采样人员依据患者主诉症状和其进食食品类型推测其可能感染的致病菌类型而有针对性地采集可疑的样本送检；(3)除了沙门氏菌和副溶血性弧菌外，其他致病菌检出率极低，原因可能为检测设备不全，灵敏度低，检测范围小，细菌性食物中毒病原菌的检测多为传统生化鉴定，经历增菌、分纯、鉴定，需7 d左右的时间，无法同时兼顾多种可疑病原菌进行检测，且常根据采样人员现场流行病学调查，判断可疑目标菌而进行鉴定，未能对其他常见或少见的病原菌进行检测，造成检测范围不全。因此，实验室应改进检测手段，采用微生物质谱仪或PCR或多重RT-PCR等分子检测技术，对食物中毒样本进行快速筛查，扩大检测范围，提高检出率，再行传统生化鉴定，对病原菌的血清型、耐药性、肠素菌等进行细致化分析，建全检测数据，提高检测能力，不断积累丰富揭阳市细菌性食物中毒病原学特征资料，为食品监管部门制定科学防控策略提供依据。