尿液生物标志物在狼疮性肾炎诊断和进展评估中的应用研究进展

刘利婷，张慧杰，阿丁嘎，吴 钰，董海荣

(1.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010110；2.呼和浩特市第一医院检验科，内蒙古 呼和浩特 010030)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种慢性、累及多系统的自身免疫性疾病，其发病机制多与遗传、激素、病毒及药物等因素有关。肾脏是SLE患者最常受累的器官之一，约50%的SLE患者会出现肾脏受损，即狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)[1]。LN病情波动较大，呈反复迁延，需对患者进行随访、监测，以便实时调整治疗方案。目前,肾脏病理活检是诊断LN的金标准，同时也是判断疾病严重程度和治疗反应性的重要依据。但频繁的肾脏病理活检将增加患者发生并发症的风险。因此，肾脏病理活检在LN患者中的应用较为局限，探索LN潜在的生物标志物具有重要的临床价值。常规的尿液实验室检查指标如尿蛋白、尿白蛋白/肌酐比值、尿沉渣管型等和血液实验室检查指标如抗双链DNA抗体(anti-dsDNA antibody，anti-dsDNA)、血清补体等,可以作为辅助判断LN严重程度的依据[2]。本文就尿液中与LN相关的生物指标进行综述，旨在为LN相关标志物的开发与临床应用提供参考。

1 LN的病理生理机制

SLE具有遗传易感性，多发于青年女性，其发病机制极其复杂。SLE患者因病毒、环境、药物等多种因素共同作用引起机体的免疫系统紊乱，首先，部分凋亡细胞和损伤细胞的清除发生障碍，释放出大量核酸和蛋白质成分，然后，这些成分刺激免疫系统产生抗核抗体等多种自身抗体，自身抗体与自身抗原形成免疫复合物(immune complex，IC)[3]。IC主要来源于循环免疫复合物(circulating immune complexes，CIC)和原位免疫复合物。CIC是LN一系列发病机制的触发器，其在外周产生并随着血液流动沉积于肾脏[4]。原位免疫复合物是由自身抗体与肾小球抗原结合，在肾小球原位形成[5]。IC在肾脏沉积后活化补体系统，后者与免疫球蛋白Fc部分c末端的Fc受体(receptors Fc,FcR)结合，激活炎症级联反应，使中性粒细胞活化；另一方面，IC会刺激肾小球内皮细胞、系膜细胞和巨噬细胞等产生大量的细胞因子和趋化因子，最终触发巨大的免疫炎症反应损伤肾脏[6-10]，导致LN(图1)。

图1 LN的发病机制

2 LN中的潜在尿液生物标志物

LN主要以肾免疫循环复合物沉积以及补体、细胞因子和趋化因子的异常表达为特征。早期检测尿液生物标志物如脲酶、细胞因子、趋化因子、血管分子等的异常表达，可用于以疾病正常生理或病理过程中的诊断指标，并监测疾病进程及预后，便于临床医生采取治疗措施。

2.1 嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)与LNNGAL属于尿酶分子，相对分子质量为25 000，其在活化的白细胞与肾小管上皮细胞中呈高表达。研究显示，NGAL可作为急性肾损伤的预测因子，其在缺血性肾损伤或药物引起的肾毒性或肾损伤中呈高表达[11]。

研究显示，尿NGAL与SLE疾病活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)有关，可用于区分活动性与非活动性LN患者[12]。TORRES-SALIDO等[13]的一项研究显示，Fe NGAL/Fe蛋白比值可用于评估LN患者是否处于活动期及其活动程度，并作为观察治疗反应的可靠指标。

EL SHAHAWY等[14]研究显示，尿NGAL诊断LN的灵敏度与特异度分别为92%、75%，曲线下面积为0.959，有显著的诊断性能，可作为一种诊断LN的潜在生物标志物。同时，有研究认为，尿NGAL与LN的病理分级有关，重度LN患者尿液中NGAL水平显著高于轻度LN患者，且具有良好的灵敏度和特异度，说明尿NGAL在LN的分型诊断方面具有潜在作用[15]。此外，监测尿NGAL水平可以评估活动性LN患者经过6个月诱导治疗后的效果，因此，尿液NGAL增加对于预测LN患者治疗后的良好反应有潜在的作用[16]。但KIANI等[17]的研究结果与此相反，其研究显示尿NGAL与LN 之间相关性较小，因此还需要进一步的研究证实。

2.2 肿瘤坏死因子相关凋亡的弱诱导剂(tumor necrosis factor-related weak inducer of apoptosis，TWEAK)与LNTWEAK属于肿瘤坏死因子超家族的成员，由不同的肾细胞分泌，是一种多功能的细胞因子。TWEAK与其唯一的受体成纤维细胞生长诱导因子14(fibroblast growth factor-inducible 14,Fn14)结合可激活经典与非经典的核因子κB (nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路以及其他激酶系统，使其诱导分泌其他与LN高度相关的细胞因子，如趋化因子C-C-基元配体5(chemokine CCL5,CCL5)/受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(regulated upon activation,normal T cell expressed and secreted,RANTES)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein,MCP-1)/趋化因子CC亚家族受体2(CC chemokine receptor,CCR2)、干扰素-γ诱导蛋白-10 (interferon-γ-induced protein-10,IP-10)和血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)等，炎症因子的过度表达可能会加剧LN的局部炎症[18-20]。在正常组织中TWEAK和 Fn14表达水平相对较低，而在急性或慢性炎症组织中Fn14表达显著增加，同时调整TWEAK水平相应增加。

越来越多的研究证明，TWEAK/Fn14信号通路参与了LN的发病机制，可作为监测LN活性潜在的生物标志物[21-23]。有研究表明，活动性LN患者的尿TWEAK水平显著高于非活动性LN患者，且其水平与SLEDAI相关[24]。研究发现，在LN发作时，患者接受免疫抑制剂的治疗后，监测患者的尿TWEAK水平可以预测其对治疗的反应，数据显示，完全缓解患者的尿TWEAK 水平始终较低，部分缓解患者的尿TWEAK 水平在治疗的第 3 个月时呈下降趋势，而未缓解患者的尿TWEAK 水平持续升高[23]。此外，尿TWEAK水平评估LN活动度的效果优于anti-dsDNA和补体水平联合监测的效果[25]。以上研究均表明，TWEAK有望成为LN诊断及病情监测的参考指标。

2.3 MCP-1与LNMCP-1属于CC类趋化因子(又称β趋化因子，因其近氨基端的2个丝氨酸残基是相邻排列的，故称CC类)，主要表达于单核细胞、活化的巨噬细胞、T细胞和自然杀伤细胞，在肾脏炎症发生、发展过程中能调节炎症细胞的迁移。MCP-1通过与其受体CCR2结合后激活相关信号通路，趋化多种免疫细胞到达炎症部位，最终导致器官损伤[26-27]。

近年研究发现，MCP-1与多种自身免疫性疾病相关,在SLE、类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病等疾病过程中起着重要作用[28-31]。研究证明，与非活动性LN患者、非肾性SLE患者以及健康者相比，活动性LN患者的尿MCP-1水平显著升高[32-33]。同时，最近的一项研究表明，尿MCP-1与SLEDAI呈正相关[34]。此外，尿MCP-1与患者接受诱导治疗的反应相关，免疫抑制治疗反应不佳患者的尿MCP-1 和anti-dsDNA水平显著增加[35]。SINGH等[36]研究显示，随着LN病情的发展，患者的尿MCP-1水平显著增高，且与LN的类型和发作的严重程度相关。因此，尿MCP-1可作为监测LN的活动与发作的潜在标志物。

2.4 VCAM-1与LNVCAM-1属于免疫球蛋白超家族成员中的一种血管分子，常表达于内皮细胞中，与位于白细胞上的整合素晚期抗原4(very late antigen-4,VLA-4)结合后参与炎症细胞的浸润和募集[37-38]。在LN的小鼠模型中，内皮细胞、肾小管皮质细胞和肾小球细胞等许多细胞在炎症介质的诱导下可分泌VCAM-1，VCAM-1的表达加剧了T细胞和巨噬细胞对肾脏的损害[39]。其他临床研究也证实，SLE患者的肾脏、血清和尿液中VCAM-1水平均异常增加[40-41]。

MOK等[40]研究发现，活动性LN患者的尿VCAM-1水平升高，可用于区分活动性LN患者和无肾损伤的SLE患者。GASPARIN等[38]就尿VCAM-1水平对LN疾病的活动程度反映作了进一步探讨，发现活动性LN患者尿液中的VCAM-1水平升高，而非活动性LN患者则无变化；同时，在LN发作期间尿VCAM-1水平会达到峰值，随着疾病的缓解其水平会逐渐下降，且尿VCAM-1水平与SLEDAI评分有关。在组织学方面， ABD-ELKAREEM等[42]研究显示，经活检确诊的Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ级LN患者的尿VCAM-1水平高于Ⅰ、Ⅱ级LN患者，尿VCAM-1水平可用于监测LN患者的病情。但GASPARIN等[38]却认为不同病理类型的LN患者的尿VCAM-1水平比较差异无统计学意义。以上研究结果的不同可能与被研究人群或者检测技术的不同有关。

3 尿液蛋白组学

随着LN的发病率及全因死亡率逐年增加，LN的诊断越来越被重视，美国风湿病学会强调了在SLE的诊断和预后中，蛋白质生物标志物具有重要价值。蛋白质组学的研究进展为靶向治疗SLE和LN提供了新的思路。

3.1 尿液蛋白组学的方法学评价正常生理条件下，尿液是血液经肾脏滤过与重吸收所形成的产物，这意味着尿液不仅可以反映血液的状况，还可以显示机体的状态。而且，尿液中含有的蛋白质较少，在用质谱分析技术鉴定蛋白质时，不必进行复杂的处理。病理情况下，肾脏疾病所涉及的生物介质大多由炎症细胞或肾脏的细胞产生，这些介质在尿液中的水平可评估其与肾脏病理学之间的联系，使其与疾病部位有更好的相关性。此外，尿液中缺乏活性蛋白酶，限制了尿液中蛋白质的降解，在对生物标志物进行定性和定量时可得到更准确的结果[43]。因此，与具有创伤性的活检和血液采集相比，尿液采集的非侵入性、便捷性使其成为LN生物标志物的理想来源。

尿液作为生物标志物来源有一定的优势，但样本采集如何标准化还有待明确。首先，主要障碍在于不同个体之间的尿液会受到其年龄、性别以及生活方式等因素的影响[44]。另一障碍是目前尿液蛋白组学缺乏样本采集、储存和处理及分析的标准,从而导致实验结果不可重复[45]。另外，需要指出的是，单独使用本文所提到的这些生物标志物评估LN活动性和严重程度的灵敏度和特异度不如多种生物标志物联合评估高，故需多种生物标志物联合检测以监测复杂的疾病状况。

3.2 尿液生物标志物联合诊断LNBRUNNER等[46]基于6种尿生物标志物浓度的测量构建了一个组合，以评估LN的活性，称为LN活动性指标(renal activity index for lupus,RAIL),包括NGAL、肾损伤因子-1(kidney injury molecule-1,KIM-1)、铜蓝蛋白、脂联素、血红素结合蛋白和MCP-1。

3.2.1 RAIL在肾脏中的功能RAIL包含的6种生物标志物除MCP-1之外，其余5种在保护肾脏免受炎症损害方面均有很强的生物学作用。NGAL是一种铁载体蛋白，铁具有保护和增强细胞修复的特性。同时，铁在调节细胞自噬中具有重要作用；自噬是一种分解代谢过程，通过溶酶体水解受损的蛋白质以维持细胞存活[47-49]，NGAL在肾脏中参与自噬，再加上其具有抗凋亡的作用，以上作用共同对肾脏起到保护。KIM-1可增加肾小管上皮细胞对白蛋白的吞噬作用，且在去除凋亡细胞和坏死组织碎片中起作用，从而减轻肾损伤；除了介导吞噬作用外，KIM-1 还参与肾小管上皮细胞损伤后的修复过程[50]；以上研究结果说明KIM-1 参与了肾脏保护机制。铜蓝蛋白是一种抗氧化剂，其具有铁氧化酶功能，可将对肾小管具有高度破坏性的亚铁转化为无毒的三价铁构型[51]。脂联素是一种由脂肪细胞分泌的脂肪因子，通过与其受体结合而具有肾脏保护特性[52]。血红素结合蛋白是一种由肝细胞表达的蛋白酶，可保护肾小管免受游离血红素自由基的毒性，此外还可通过几种炎症因子的诱导发挥抗炎作用[53]。与以上5种生物标志物不同的是，MCP-1是招募和引导白细胞运动的关键趋化因子之一，MCP-1的表达使白细胞的黏附游走能力加强，便于白细胞游走到受损部位，从而引起炎症反应[54]。有研究指出，减少肾脏 MCP-1 表达和巨噬细胞募集，可改善肾脏蛋白尿的症状,所以，抑制 MCP-1/CCL2通路可成为肾脏疾病治疗的潜在方案[55]。

3.2.2 RAIL的有效性研究显示,RAIL组合预测LN活动的灵敏度高达92%；此外，其能够在治疗3个月内预测疗效，可以作为LN活性以及治疗反应的预测因素[45]。更重要的是，该组合不仅在诊断方面有显著价值，而且它们保护肾脏的作用及其他功能有助于研究LN机制以及确定新的治疗靶点，从而帮助临床医生进行个体化治疗。值得注意的是,虽然RAIL标志物组合有较高的灵敏度，但特异度却较低，该组合所有标志物的表达水平在其他类型的急性和慢性肾损伤中也有升高。同时，这个预测标志物组合是在儿童群体中开发的，GULATI等[56]也在成人中验证了该组合的有效性，该模型能够成功地区分LN 的高活性和中/低活性，准确度为 88%，与BRUNNER等[46]在LN 儿童中得到的研究结果一致，但尚需要在其他人群中进行大规模的研究以验证其性能。

4 总结与展望

由于LN发病机制复杂，其临床表现往往与病理检查不一致，导致LN的诊断比较困难，故LN患者有较高的病死率。随着对LN发病机制的进一步了解，临床上的治疗方法有所改进，但如何降低LN患者的病死率仍是一个巨大的挑战。生物标志物可用于LN的病情诊断、动态监测以及治疗效果和预后追踪，尿液生物标志物因其具有无创伤采样的特性，更是展示出了巨大的潜力，给LN患者的诊断提供了新的策略。但目前尚无实际应用于临床的标准化尿生物标志物。因此，如何将尿生物标志物标准化并在不同种族人群中进行大规模纵向研究，进而验证其应用于LN诊断和进展评估的有效性，是需要进一步研究的方向。